Преэклампсия является осложнением беременности с высокой материнской и перинатальной заболеваемостью и смертностью, в реализации которого участвует множество генетических и средовых факторов [10]. Эндотелиальная дисфункция является ведущим фактором патогенеза преэклампсии [2], однако, роль оксида азота (NO) в ее реализации при гестационном повышении артериального давления (АД) дискутабельна. Вместе с тем при преэклампсии уровень этого вазодилятатора снижается, что может быть ассоциировано с генетическим полиморфизмом эндотелиальной синтазы NO, кодируемой геном NOS3 [5, 6]. Гуанин связывающие белки (G-белки) экспрессируются во всех клетках организма и играют главную роль в передаче сигналов от множества рецепторов с поверхности клетки. Минорный аллель 825T гена субъединицы бета-3 G-белка (GNB3) связан с образованием варианта протеина, обладающего повышенной биологической активностью, приводящей к усиленной сигнальной трансдукции [4, 9]. Полиморфизм C825T гена GNB3 ассоциируется с эндотелиальной дисфункцией [4], однако его связь с преэклампсией остается предметом дискуссий.
Необходимо отметить, что преэклампсия является мультифакториальным заболеванием с высоким коэффициентом наследуемости, для которого характерно отсутствие воспроизводимости результатов исследования монолокусных ассоциаций в различных популяциях. Объяснение данного феномена находят в явлении межгенных взаимодействий [1]. Мультилокусный анализ полиморфизмов генов, влияющих на функцию эндотелия, может выделить патогенетически значимые комбинации локусов, ассоциированных с преэклампсией, для прогнозирования этого осложнения беременности.
Целью исследования явилось проведение анализа ассоциации полиморфизма C825T гена GNB3, а также полиморфизмов -786T/C и Glu298Asp гена NOS3 с преэклампсией.
Материалы и методы исследования
Обследовано в III триместре 124 беременные с преэклампсией (основная группа) и 112 беременных с нормальным течением гестации (контрольная группа) из популяции русских, проживающих на территории Тверской области. Критерии включения в основную группу: клиническое АД ≥ 140/90 мм рт. ст. и суточная протеинурия > 0,3 г/л, впервые выявленные после 20 недели гестации. Средний возраст в группах - 27,6 ± 4,3 и 25,7 ± 3,5 года. По данным суточного мониторирования среднесуточное систолическое АД в основной группе - 132,57 ± 2,78, в контрольной группе - 109,89 ± 1,53 мм рт. ст. (p = 0,046), среднесуточное диастолическое АД - 81,05 ± 1,99 и 65,45 ± 0,90 мм рт. ст. соответственно (p = 0,032).
Геномную ДНК выделяли из крови сорбентным методом с использованием набора «Diatom DNA Prep 100» (ООО «Лаборатория «Изоген», Россия). Однонуклеотидные полиморфизмы -786T/C (rs2070744) и Glu298Asp (rs1799983) гена NOS3, а также C825T (rs5443) гена GNB3 типировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием наборов праймеров и аллель-специфических разрушаемых гибридизационных зондов («Applied Biosystems», США). В качестве детектирующего амплификатора применяли систему регистрации ПЦР в реальном времени «ABI Prism 7500» («Applied Biosystems», США).
Статистический анализ данных выполнен с помощью on-line калькулятора на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия; http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl). Распределение генотипов проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью критерия χ2, а также при сравнении с параболой DeFinetti. Различия по частоте аллелей и генотипов между группами оценены критерием χ2 Пирсона. Для оценки ассоциации генотипов и аллелей с преэклампсией рассчитаны отношения шансов (odds ratio, OR) с 95 %-м доверительным интервалом (confidence interval, CI). Анализ межгенных взаимодействий проведен методом сокращения многофакторной размерности (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR) в среде открытой программы MDR v.2.0 beta8 (http://www.multifactordimensionalityreduction.org). Метод MDR был разработан для моделирования межгенных взаимодействий высокого порядка, которые невозможно оценить с помощью традиционно используемых в генетической эпидемиологии параметрических методов [7].
Результаты исследования и их обсуждение
Распределение частот генотипов C825T гена GNB3 соответствовало закону Харди-Вайнберга (в группе контроля χ2 = 0,21, р = 0,65, среди беременных с преэклампсией χ2 = 0,40, р = 0,53). Отмечается ассоциация полиморфизма C825T гена GNB3 с преэклампсией (табл. 1). Так, вариантный аллель 825Т гена GNB3 ассоциирован с преэклампсией, т. к. его носительство увеличивает в 1,6 раза риск этого осложнения беременности. Напротив, аллель С изучаемого полиморфного маркера является «протективным» в отношении преэклампсии. Было показано, что вариант 825Т является аллелем риска преэклампсии независимо от состава исследуемой популяции [9]. Вместе с тем связь этого генетического маркера с эндотелиальной дисфункцией при чистом варианте преэклампсии не подтверждена, однако присутствует в случае присоединения HELLP синдрома [4]. Фенотипическими особенностями носителей аллеля 825Т гена GNB3 в отличие от гомозигот СС могут быть более высокие показатели АД, избыточная масса тела, эндотелиальная дисфункция [4, 8].
Таблица 1
Частота генотипов и аллелей полиморфизма C825T гена GNB3 в контрольной группе беременных и группе пациенток с преэклампсией
|
Генотипы и аллели |
Контроль (n = 112) |
Преэклампсия (n = 124) |
Критерий χ2 (р) |
OR (95 % CI) |
|
Генотип СС |
73 (65,2 %) |
68 (54,8 %) |
5,15 (0,08) |
0,65 (0,38-1,10) |
|
Генотип СТ |
36 (32,1 %) |
45 (36,3 %) |
1,20 (0,70-2,06) |
|
|
Генотип ТТ |
3 (2,7 %) |
11 (8,9 %) |
3,54 (0,96-13,02) |
|
|
Аллель С |
181 (73,0 %) |
181 (81,3 %) |
4,53 (0,03) |
0,62 (0,40-0,97) |
|
Аллель Т |
67 (27,0 %) |
42 (18,8 %) |
1,60 (1,04-2,48) |
Распределение частот генотипов полиморфизмов гена NOS3 также соответствовало закону Харди-Вайнберга, за исключением генотипов локуса NOS3/Glu298Asp в группе беременных с нормальным течением гестации. Для полиморфизма Glu298Asp в группе контроля χ2 = 7,51 (р = 0,006), среди пациенток с преэклампсией χ2 = 0,57 (р = 0,45), для полиморфизма -786T/C в аналогичных группах: χ2 = 1,44 (р = 0,23) и χ2 = 0,49 (р = 0,48) соответственно.
Статистически значимых различий по частоте генотипов и аллелей полиморфизма -786T/C гена NOS3 между группами беременных в нашем исследовании не установлено (табл. 2). Однако мутантный аллель -786C гена NOS3 связан с проявлениями дисфункции эндотелия и преэклампсией в близкой к нашей восточноевропейской популяции, несмотря на то, что у носителей этого аллеля концентрация NO в плазме крови выше [5].
Полиморфизм Glu298Asp гена NOS3 ассоциирован с преэклампсией. Так, гетерозиготный генотип увеличивает риск преэклампсии в 2,45 раза, а носительство аллеля 298Asp - в 1,92 раза. Напротив, присутствие аллеля 298Glu или генотипа Glu/Glu ассоциируется с уменьшением вероятности гестационного повышения АД. Кроме того, носительство гаплотипа «Asp298-786C-4b» гена NOS3 связано с двукратным увеличением риска преэклампсии при сравнении с гаплотипом «Glu298-786T-4b» [6]. Однако утверждению о связи полиморфизма Glu298Asp гена NOS3 с преэклампсией противоречат весьма обширные мультипопуляционные исследования типа случай-контроль [10]. С другой стороны, носительство «протективного» аллеля 298Glu ассоциировано с увеличением уровня NO в плазме, что, вероятно, может защищать от развития преэклампсии [5].
Проведено моделирование межгенных взаимодействий исследованных полиморфизмов при преэклампсии методом MDR, позволившее выбрать комбинации полиморфных локусов, которые имеют наибольшую патогенетическую значимость для развития этого осложнения беременности. Статистически значимой оказалась трехлокусная модель GNB3/C825T×NOS3/Glu298Asp×NOS3/(-786T/C), которая обладает 100 %-й воспроизводимостью (Cross-validation Consistency) и 84,6 % точностью предсказания (Testing Balanced Accuracy) (p = 0,025).
Методом MDR установлено, что наибольшая доля энтропии в отношении статуса «случай-контроль» связана с локусом NOS3/Glu298Asp и равна 14,12 %. Локусы GNB3/C825T и NOS3/(-786T/C) объясняют только 1,31 и 0,79 % энтропии соответственно. Данные результаты согласуются с результатами монолокусного анализа ассоциаций для локуса NOS3/Glu298Asp. В то же время межгенные взаимодействия пар локусов GNB3/C825T×NOS3/Glu298Asp и NOS3/(-786T/C)×NOS3/Glu298Asp являются довольно слабыми (0,05 и 0,56 % энтропии соответственно). Напротив, на долю комбинации локусов GNB3/C825T×NOS3/(-786T/C) приходится 9,15 % фенотипической энтропии, что демонстрирует выраженный синергический эффект обоих полиморфизмов. На рисунке представлена дендрограмма кластерного анализа результатов моделирования межгенных взаимодействий методом MDR при гестозе. Результаты нашего исследования согласуются с данными о нелинейных эпистатических взаимодействиях полиморфных генов, участвующих в регуляции артериального давления [3].
Дендрограмма межгенных взаимодействий локусов
GNB3/C825T, NOS3/(-786T/C) и NOS3/Glu298Asp при преэклампсии
Заключение
Таким образом, аллель 298Asp гена NOS3 и 825T гена GNB3 ассоциированы с гестозом. Аллель 298Glu и генотип Glu/Glu гена NOS3, а также аллель 825C гена GNB3 связаны со снижением риска заболевания. В то время как полиморфный локус NOS3/Glu298Asp оказывает выраженный независимый эффект в формировании преэклампсии, локус NOS3/-786T/C вносит вклад в фенотипическую реализацию этого осложнения беременности преимущественно за счет синергического взаимодействия с полиморфным локусом GNB3/C825T.
Рецензенты:
Мазур Е.С., д.м.н., профессор, зав. кафедрой госпитальной терапии и профессиональных заболеваний ГБОУ ВПО «Тверская ГМА Минздравсоцразвития России», г. Тверь;
Петрова М.Б., д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологии ГБОУ ВПО «Тверская Тверская ГМА Минздравсоцразвития России», г. Тверь.
Работа поступила в редакцию 21.09.2011.