Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время трансплантация фетальной и эмбриональной нервной ткани используется для восстановления нарушенных функций мозга в результате нейродегенеративных заболеваний, инсультов и ишемии мозга [2, 3]. Незрелая трансплантированная ткань оказывает положительное влияние на поврежденный мозг благодаря содержанию биологически активных веществ и ростовых факторов. Однако для функциональной интеграции трансплантатов с мозгом реципиента необходимо формирование между ними реципрокных аксональных связей. Работы, выполненные в последние годы, показывают, что трансплантированные нейроны формируют в мозге реципиента как адекватные, так и эктопические проекции [1, 7]. Однако молекулярные и клеточные механизмы, которые контролируют процесс формирования синаптических функциональных контактов между трансплантированной незрелой нервной тканью и зрелыми нейронами мозга реципиента, не изучены. Наибольшую загадку представляет процесс взаимной адаптации пре- и постсинаптических нейронов при гетеротопической трансплантации. В настоящей работе были изучены адаптивные изменения в ультраструктуре и везикулярном составе гигантских синапсов зубчатой извилины гиппокампа при ее трансплантации в область неокортекса, с которым она в норме не взаимодействует. Нейромедиаторный состав гигантских синапсов хорошо известен. Основным трансмиттером в них является глутамат, содержащийся в малых светлых везикулах. Большие электронно-плотные пузырьки в этих синапсах хранят нейропептидные ко-трансмиттеры, главным образом динорфин и энкефалин [9]. Кроме мультимедиаторной системы нейропередачи гигантские синаптические окончания обладают специфическим набором молекул клеточной адгезии, которые формируют выраженные адгезионные соединения с поверхностью дендри- тов [5, 8].

Целью работы было выяснение структурных и нейрохимических механизмов, вовлекающихся в процесс функциональной интеграции гетеротопических трансплантатов зубчатой извилины гиппокампа с соматосенсорной областью неокортекса мозга реципиента.

Работа выполнена на крысах породы Вистар с соблюдением рекомендаций работы с животными, изложенными в Директивах Европейского Сообщества. Зубчатая извилина гиппокампа была выбрана в качестве донорской структуры для трансплантации, т.к. аксоны гранулярных нейронов, входящие в состав этой структуры, заканчиваются гигантскими синаптическими окончаниями, которые можно легко идентифицировать на ультраструктурном уровне. Они характеризуются большими размерами терминальных бутонов (до 5 мкм), интратерминальным способом формирования активных зон с дендритными шипиками и выраженными адгезивными соединения с поверхностью дендритных стволов [1, 4, 11]. Эмбриональную закладку зубчатой фасции выделяли из плодов 19-20 дней гестации; реципиентами служили девять половозрелых самцов. Для трансплантации производили трепанацию черепа над соматосенсорной областью неокортекса (координаты: AP = + 2,0; L = 5,5) и отсасывали небольшой объем ткани мозга, куда помещали кусочек эмбриональной закладки зубчатой извилины. Через 5 месяцев мозг животных фиксировали с помощью перфузии 2,5 %-м раствором глутарового альдегида. Затем из оперированного полушария выделяли трансплантат с прилежащей к нему областью неокортекса, а из противоположного - гиппокамповую формацию для контрольных исследований. Все процедуры с животными проводили под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно) и местной анестезией (2,0 %-й новокаин, подкожно). Далее кусочки мозга разрезали на тонкие пластины, дофиксировали осмиевой кислотой и обрабатывали для электронной микроскопии по стандартной методике. Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе JEM-100B (Япония). Фотопластины с микроизображениями гигантских синапсов, полученные в микроскопе, сканировали, сохраняли в виде компьютерных файлов и производили количественный и морфометрический анализ с помощью программы UTHSCSA Image Tool. Для этого использовали не менее 50 микроизображений синаптических окончаний из контрольной и экспериментальной групп. Проводили сравнительный количественный анализ везикулярного состава и степени выраженности адгезивных соединений в гигантских синапсах в норме и после трансплантации. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.

Трансплантаты, содержащие зрелые нервные и глиальные клетки, были обнаружены у всех экспериментальных животных. Электронная микроскопия показала, что все нейроны в трансплантатах имели хорошо дифференцированные дендритные и аксональные отростки, активно вступающие в синаптические взаимодействия друг с другом. Кроме того, гранулярные нейроны также проецировали свои аксоны в мозг реципиента. Между трансплантатами и мозгом животных-реципиентов наблюдались пучки аксонов и дендритов, которые в сопровождении астроцитарных отростков проникали в мозг реципиента. Среди них идентифицировались тонкие (около 0,1 мкм в диаметре) немиелинизированные аксоны, принадлежащие трансплантированным гранулярным клеткам зубчатой извилины.

В прилежащем к трансплантату неокортексе, благодаря уникальным ультраструктурным признакам, были идентифицированы гигантские окончания аксонов гранулярных нейронов. В мозге реципиента они контактировали с дендритами и дендритными шипиками нейронов соматосенсорной области. Такие синаптические окончания представляли собой химеры, в которых пресинаптические элементы принадлежали нейронам трансплантата, а постсинаптические элементы - нейронам животного-реципиента. Как и в норме, аксональные терминальные бутоны достигали 5-6 мкм в поперечнике, хотя некоторые их профили, обнаруженные в неокортексе, были по размерам несколько меньше. Как и в норме, они содержали два типа синаптических везикул: малые светлые везикулы и крупные нейропептидные гранулы. Эктопические гигантские синапсы гранулярных нейронов также воспроизводили два типа функциональных контактов с постсинаптическими нейронами: интратерминальные активные зоны с инвагинированными дендритными шипиками и адгезивные десмосомоподобные соединения с поверхностью дендритов. Около активных зон концентрировались синаптические везикулы, а около адгезивных соединений они всегда отсутствовали. В то же время рядом с адгезивными участками в пресинаптической части синапсов обычно присутствовали митохондрии, а в постсинаптической части - цистерны эндоплазматического ретикулума. Эктопические синаптические окончания имели морфологические признаки функционально зрелых контактов (рисунок).

При сравнении гигантских синапсов, сформированных на несвойственных им нейронных мишенях при трансплантации, с таковыми в контрольном гиппокампе выявились значительные различия в распределении больших гранулярных везикул. В норме они, как правило, были распределены равномерно по синаптоплазме, а в случаях примембранной локализации располагались вдали от синаптических активных зон. В экспериментальных условиях нейропептидные гранулы имели тенденцию скапливаться в области синаптических контактов. В эктопических гигантских синапсах по сравнению с нормой была также выявлена реорганизация адгезивных соединений. Даже визуальный электронно-микроскопический анализ показал, что они более многочисленны и осмиофильны. Часто симметричные адгезионные контакты наблюдались на стволах дендритов в местах ответвления дендритных шипиков. Иногда наблюдалась транслокация адгезионных соединений на ножки дендритных шипиков и даже их пространственное слияние с синаптическими активными зонами.

Количественное и морфометрическое исследование гигантских синапсов в норме и после трансплантации подтвердило ультраструктурные наблюдения о значительной реорганизации их важных структурных и нейрохимических составляющих. Полученные цифровые значения представлены в таблице.

Количественный анализ нейропептид-содержащих гранул (НПГ) и адгезивных контактов (АК) в гигантских окончаниях мшистых волокон в норме и после трансплантации, (M ± m)

Примечание. Достоверность различий: * - p ≤ 0,01, ** - p ≤ 0,001 по сравнению с контролем для каждого параметра.

Результаты статистической обработки количественных данных показали достоверные различия всех использованных для сравнения параметров. Во-первых, в эктопических гигантских синапсах были выявлены изменения в нейромедиаторном составе синапсов. Обнаружено значительное увеличение (в 1,7 раз) числа нейропептидных грунул относительно общего числа синаптических везикул. При этом число синаптических активных зон, в состав которых входили большие гранулярные пузырьки, содержащие нейропептиды, возросло в 7,9 раз. Это свидетельствует о том, что при формировании аберрантных аксональных связей нейропептидные ко-трансмиттеры воздействуют непосредственно на постсинаптические рецепторы нейронов неокортекса или модифицируют их для контакта с чужеродными аксонами. Известно, что эндогенные нейропептиды синтезируются в телах нейронов, упаковываются в большие электронноплотные пузырьки и транспортируются в аксональные терминали. Они обычно освобождаются вдали от активных зон и ретроградно модулируют выброс основного медиатора глутамата. Как правило, нейропептиды оказывают тормозное воздействие и восстанавливают баланс между возбуждением и торможением. В ряде областей мозга крысы, в том числе, и в системе мшистых волокон гиппокампа, активация нейронов вызывает усиление секреции нейропептидов. Они вовлекаются в развитие долговременной посттетанической потенциации [6]. Модулирующая роль пептидной ко-трансмиссии в реорганизации нейро-нейрональных связей при регенерации мозга позвоночных животных показана нами впервые.

Во-вторых, по сравнению с мозгом in situ в гигантских синапсах после трансплантации было выявлено значительное увеличение количества и протяженности адгезионных контактов. Отношение зон адгезии к полной длине аппозиции терминали и дендрита превосходило в 3,6 раза (см. таблицу). Необходимо подчеркнуть, что концентрация молекул клеточной адгезии в постсинаптических областях не свойственна нейронам неокортекса в норме и, по-видимому, индуцирована пресинаптическими аксональными системами нейротрансплантатов. Полученные нами ранее [11] ультраструктурные свидетельства усиления локального синтеза метаболитов в постсинаптических дендритах и дендритных шипиках эктопических синапсов подтверждают такое предположение. Прежде адгезивным соединениям в гигантских синапсах гиппокампа приписывали исключительно механическую функцию, предназначенную для прикрепления терминали к дендриту [4]. С помощью современных методов молекулярной биологии идентифицирован их сложный нейрохимический состав. В организацию этих контактов входят кадгерин-катениновая и нектин-афадиновая адгезивные системы, а также синаптическая адгезионная молекула S-SCAM. Адгезивные системы играют ключевые роли в развитии и физиологии нервной системы. Они управляют эффективностью синаптической передачи, участвуют в морфогенезе дендритных шипиков, координируют сложные биохимические сигнальные процессы в пре- и постсинапсе [8, 10]. Указанные молекулярные соединения присутствуют и в других аксонных путях мозга, однако только в окончаниях аксонов гранулярных нейронов зубчатой извилины они сконцентрированы в специ­фические структурные конгломераты. Возможно, эти нейрохимические особенности определяют уникальные пластические свойства гранулярных клеток, позволяющие им встраиваться в уже существующие нейронные сети во время их генеза из клеток-предшественников в зрелом мозге.

Таким образом, проведенное ультраструктурное исследование показало, что гетеротопически трансплантированная эмбриональная ткань зубчатой извилины гиппокампа крысы успешно интегрируется с помощью синаптических связей с мозгом взрослого животного-реципиента. При формировании синаптических взаимодействий между нейронами трансплантатов зубчатой извилины и нейронами соматосенсорной области неокортекса реципиента происходит взаимная структурно-химическая адаптивная реорганизация как пре-, так и постсинаптических отделов эктопических гигантских синапсов. В процессе образования и последующей стабилизации функциональных связей участвуют эндогенные нейропептиды и молекулы клеточной адгезии. Мы полагаем, что нейропептидные котрансмиттеры и адгезивные молекулы являются составной частью сложного молекулярно-клеточного механизма, координирующего установление аберрантных аксональных связей между трансплантатом и мозгом реципиента.

• Архипов В.И., д.б.н., ведущий научный сотрудник учреждения Российской академии «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», г. Пущино;
• Кичигина В.Ф., д.б.н., зав. лабораторией ИТЭБ РАН учреждения Российской академии «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 30.06.2011.