Одной из важнейших задач медицины является восстановление поврежденных суставов. В настоящее время для ускорения регенерации суставных поверхностей в их дефекты вводят различные материалы, улучшающие скольжение и предохраняющие хрящевые поверхности от дальнейшей деструкции. Оптимальным считается применение материалов, вызывающих минимальную макрофагальную и соединительно-тканную реакцию и индуцирующих формирование как можно более тонкой капсулы вокруг имплантированного объекта.
Тканевой ответ на имплантацию инородного тела обычно включает в себя воспалительную реакцию. In vitro было показано, что лимфоциты могут влиять на способность макрофагов к адгезии к поверхности биоматериалов, но эти данные не подтвердились при исследовании на донорах. Сами макрофаги и гигантские клетки инородных тел также могут синтезировать множество цитокинов и медиаторов при контакте с различными материалами поверхностей имплантатов [9]. Однако, по другим результатам in vivo, некоторые материалы могут индуцировать выброс провоспалительных цитокинов мононуклеарами периферической крови, но это не является поликлональным активатором CD4+ Т-лимфоцитов [6].
Среди биополимеров особое место занимают биодеградируемые полигидроксиалканоаты (ПГА) - полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (масляной, валериановой и др.), которые с середины 80-х годов активно изучают в качестве материала для хирургии, тканевой инженерии и создания биоискусственных органов. ПГА могут представлять большой интерес для клинической медицины в связи с их механической прочностью, высокой биосовместимостью и медленной биодеградацией [3, 10].
Резкое возрастание в последнее время числа научных публикаций, посвященных ПГА, в Китае, Ю. Корее, Японии, Индии, Бразилии, а теперь и в России, свидетельствует о чрезвычайно интересных и полезных качествах этих полимеров. Наиболее активно и успешно изучением этой проблемы в России занимается группа учёных Сибирского федерального университета (Красноярск), которыми была разработана технология получения ПГА, сконструировано и запущено в 2005 году первое отечественное опытное производство биосовместимых и полностью рассасываемых в биологических средах полимеров различной структуры и экспериментальных изделий био-медицинского назначения. Разработанные из ПГА шовные нити, трубчатые эндопротезы и мембраны допущены к клиническим испытаниям.
К настоящему времени накоплена значительная экспериментальная база, демонстрирующая такие ценные свойства ПГА, как термопластичность, биосовместимость и, самое главное, биоразрушаемость. Термопластичность позволяет легко перерабатывать полимеры в изделия (пленки, полые формы, нити) из порошков, растворов и расплавов, подвергать подобные изделия стерилизации общепринятыми методами (сухо-жарочной обработке, автоклавированию, в дезинфицирующих растворах и гамма-облучению) без изменения структуры, потери прочности и ухудшения адгезионных свойств поверхности и без появления токсических свойств [3, 10].
Изучение процессов интеграции живых тканей и неживых материалов в различных условиях имеет большое значение для качества жизни больных, нуждающихся в ускоренной регенерации или замещении тканевых дефектов в травматологии и ортопедии, восстановительной медицине, хирургии и стоматологии.
Цель исследования. В связи с вышеизложенным, в эксперименте на крысах изучали возможность применения ПГА для воздействия на регенерацию поврежденного сустава.
Материал и методика исследования
В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag весом 180-200 г возрастом 6 месяцев. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На каждую точку исследования было не менее 6 животных.
Биодеградируемый ПГА (полигидроксибутират) в виде пленок был предоставлен для исследования Институтом биофизики СО РАН (г. Красноярск).
Модель повреждения сустава и применения ПГА в эксперименте: после обработки кожи спиртом производили разрез кожи в области передней поверхности левого коленного сустава длиной 1 см. После вскрытия суставной капсулы, стоматологическим бором диаметром 2 мм при медленных оборотах повреждали хрящ суставной поверхности большеберцовой кости на глубину 1-2 мм. В просвет сустава для прикрытия дефекта хряща помещали пленку из ПГА диаметром 5 мм. Несколькими узловыми викриловыми швами («00» с атравматическими иглами) ушивали суставную капсулу, на кожу накладывали непрерывный викриловый шов и обрабатывали послеоперационную рану спиртом. В группе крыс со спонтанным заживлением поврежденного хряща (контроль) после его повреждения сразу ушивали капсулу сустава и кожу. В связи с медленными процессами регенерации хрящевой ткани животных выводили из эксперимента через 1 и 2 месяца после операции. Все имплантированные материалы были стерильными.
Фрагменты костей бедра и голени вместе со структурами коленного сустава, имплантированным материалом и окружающими тканями фиксировали в 4 %-м растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 часов, декальцинировали в растворе «Биодек R» (Bio Optica Milano, Италия) в течение 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, изучали на световом микроскопе Axioimager М1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении до 1200 раз.
Результаты исследования и их обсуждение
В течение всего времени наблюдения воспалительных осложнений операции с имплантацией или без, а также нарушений функций поврежденной конечности, у крыс не было.
Через 1 месяц после повреждения суставной поверхности большеберцовой кости крыс в эксперименте и естественном ходе заживления (в контроле) не происходит полного восстановления структур поврежденных тканей коленного сустава. Суставные поверхности находятся друг от друга на значительном расстоянии, скорее всего, из-за значительного объема выпота, в отличие от состояния у интактных животных, где поверхности костей, образующих сустав, расположены практически вплотную (рис. 1а).
На некоторых участках суставной поверхности большеберцовой кости структура хряща полностью не восстановлена, имеются явления деструкции в подлежащих к повреждению частях кости (рис. 1б). В красном костном мозге резко увеличено количество клеток, среди которых много сегментоядерных нейтрофилов и их предшественников. Трабекулы кости, проходящие среди таких участков, гомогенизированы (рис. 1б), что, видимо, обусловлено их некротизированием. Такие изменения укладываются в патоморфологическую картину остеомиелита (рис. 1б).
а б
Рис. 1. Регенерация коленного сустава крысы после повреждения хрящевой поверхности без последующего воздействия. Окраска гематоксилином и эозином:
а - структура коленного сустава до его повреждения, суставные поверхности контактируют между собой и представлены хрящом равномерной толщины и строения, в костной ткани непосредственно под хрящом расположены полости с красным костным мозгом, увеличение Х 100; б - через 1 месяц после повреждения хряща коленного сустава присутствует дезорганизация строения хряща и кости, увеличение Х 100
На следующий срок исследования (2 месяца после повреждения коленного сустава) дефект хрящевой поверхности и нарушения строения кости сохраняются (рис. 2) в большинстве наблюдений (4 из 6 животных). Непосредственно под хрящевой тканью в кости расположены обширные полости (см. рис. 2), в некоторых таких полостях присутствуют небольшие фрагменты красного костного мозга практически нормального строения (рис. 2б). По-видимому, такие полости образовались после прекращения острого воспалительного процесса (остеомиелита), признаков которого на этот срок не было найдено ни в одном случае.
а б
Рис. 2. Регенерация коленного сустава крысы через 2 месяца после повреждения хрящевой поверхности без последующего воздействия. Окраска гематоксилином и эозином:
а - дефект хрящевой поверхности сустава и нарушения строения кости сохраняются, увеличение Х 100; б - в ткани большеберцовой кости и ее трабекул присутствуют структуры костной мозоли, признаков остеомиелита нет, но имеются обширные участки без красного костного мозга, увеличение Х 100
После применения ПГА деструктивные процессы в поврежденных суставах были выражены значительно сильнее. Следует отметить, что ни в одном наблюдении сам ПГА не был обнаружен в полости сустава.
В большинстве случаях через 1 месяц после имплантации ПГА строение хряща и подлежащих костных тканей было сильно нарушено, присутствовали выраженные признаки отека, формирование грубых структур костной мозоли и явления остеомиелита (рис. 3). В одном случае были найдены разрастания хряща (рис. 3б), которые могут быть расценены как гиперпластические, видимо, вследствие длительного раздражения регенерирующего хряща инородным телом - пленкой из ПГА.
а б
Рис. 3. Особенности восстановления хрящевой поверхности коленного сустава через 1 месяц после его повреждения и имплантации ПГА в эксперименте. Окраска гематоксилином и эозином:
а - значительное разрушение хряща суставной поверхности и подлежащих тканей,
увеличение Х 100; б - формирование грубой костной мозоли и беспорядочное разрастание хряща
К окончанию 2-го месяца после повреждения хряща и имплантации ПГА в ряде случаев было отмечено неполное восстановление структуры хрящевой ткани коленного сустава (рис. 4а). В других наблюдениях состояние хряща было практически восстановлено, но расстояние между суставными поверхностями оставалось значительно расширенным (рис. 4б). Структуры красного костного мозга в кости практически отсутствовали во всех случаях, в самой костной ткани всегда были признаки формирования костной мозоли (рис. 4б).
а б
Рис. 4. Регенерация коленного сустава крысы через 2 месяца после повреждения хрящевой поверхности и имплантации ПГА. Окраска гематоксилином и эозином:
а - неполное восстановление структуры хрящевой ткани коленного сустава,
увеличение Х 100; б - состояние хряща практически восстановлено, но расстояние между суставными поверхностями расширено, видимо, за счет выпота, структуры красного костного мозга в кости практически отсутствуют, сама костная ткань с признаками формирования костной мозоли, увеличение Х 100
Мы уже отмечали, что ни в одном наблюдении, ни через 1 месяц, ни спустя 2 месяца после имплантации ПГА этот полимер не был найден в полости коленного сустава. Однако при внимательном изучении биоптированного материала, различные по величине фрагменты ПГА были найдены у всех животных в мягких тканях вокруг суставов (рис. 5).
Иногда ПГА лежал свободно в боковых складках (заворотах) суставной капсулы (рис. 5а) (только в некоторых случаях спустя 1 месяц после имплантации). Не было отмечено ни инкапсуляции ПГА, ни его деградации (рис. 5а). Также не было признаков острого или хронического воспаления в тканях (рис. 5а), как реакции на присутствие в них инородного тела.
а б
Рис. 5. Миграция ПГА из полости сустава в окружающие ткани после повреждения хрящевой поверхности коленного сустава и имплантации ПГА в эксперименте.
Окраска гематоксилином и эозином:
а - инкапсуляция фрагментов ПГА фиброзной тканью без явлений острого или хронического гранулематозного воспаления спустя 1 месяц после операции, увеличение Х 100; б - спустя
2 месяца после имплантации ПГА фиброзная капсула содержит множество фибробластов и фиброцитов, ориентированных параллельно инородному телу, лейкоцитарной инфильтрации и гранулем инородного тела нет, увеличение Х 500
Однако значительно чаще (в большинстве случаев через 1 месяц после операции и во всех наблюдениях спустя 2 месяца) небольшие фрагменты ПГА были инкапсулированы активно пролиферирующей фиброзной тканью с большим числом фибробластов и фиброцитов (рис. 5б), эти клетки и волокна фиброзной ткани были ориентированы параллельно ПГА (рис. 5б). Такая инкапсуляция приводила к деформации ПГА (рис. 5б). Несмотря на это и возможность травматизации окружающих тканей при деформации ПГА, также не было явлений макрофагальной и лейкоцитарной реакции на инородное тело и признаков развития гранулематозного воспалительного процесса (рис. 5б). Отсутствовали и свидетельства деградации ПГА (рис. 5б).
Значительных отличий между состоянием ПГА и окружающих тканей (реакции их на ПГА, как инородное тело) через 1 и 2 месяца после имплантации полимера в сустав с поврежденным хрящом не было.
После повреждения хряща в эксперименте в тканях развивается острое воспаление. Эта реакция возникает как ответ на прямое повреждение тканей в результате хирургического вмешательства, так и на внедрение инородного тела - ПГА. Часто в этот процесс вовлекаются структуры подлежащей кости и даже костного мозга, на что указывают явления остеомиелита, обнаруженные через 1 месяц после операции. Со временем стихает воспалительная реакция, вызванная операцией, и начинается восстановление поврежденных тканей.
Суставной хрящ регенерирует очень медленно, даже в течение 2 месяцев наблюдения не происходит полного восстановления его структуры. О продолжающемся воспалении свидетельствует и выпот в полости сустава (увеличение просвета между суставными поверхностями. Вместе с этим имеются данные, что сквозные отверстия в плоских костях крыс полностью закрываются костной мозолью в течение 2-3 недель.
Используя ПГА в данном случае, мы не ожидали ускорения репарации процессов, ведь даже при его быстрой биодеградируемости было бы затрачено определенное время на этот процесс. Целью работы являлась попытка быстрого восстановления функций суставного хряща за счет консолидации ПГА к краю дефекта, протезирования им поверхности скольжения в суставе, предохранения поврежденного хряща от дальнейшей травматизации, постепенного лизиса ПГА и замещения вновь сформированным хрящом.
В литературе есть данные, что реконструктивный остеогенез происходит активно при использовании всех типов имплантатов, содержащих в качестве основного компонента ПГА полигидроксибутират. Собственно полигидроксибутират и его различные композиции обладают выраженными остеопластическими свойствами, медленно и адекватно росту новой костной ткани деградируют in vivo, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза [3, 10].
В острых и хронических экспериментах на лабораторных животных было показано, что биодеградация ПГА зависит от химической структуры полимера, от места имплантации и формы изделия, происходит медленно гуморальным и клеточным путями, главным образом с поверхности изделия, без образования локальных дефектов и резкого снижения прочности. В биодеградации ПГА принимают участие макрофаги и гигантские клетки инородных тел с высокой активностью кислой фосфатазы, коррелирующей с активностью фермента в сыворотке крови животных. Основной мишенью для полимерных частиц являются ткани печени, а также почек и селезенки. Наиболее активное разрушение полимерного матрикса микрочастиц происходит в селезенке и печени. ПГА пригодны к использованию от нескольких месяцев до года, не вызывают воспалительных, некротических, склеротических или иных негативных реакций в окружающих тканях и не препятствуют репарации in vivo, что особенно ценно для хирургических нитей, эндопротезов и остеосинтетических имплантатов. При этом деградация структуры полимера начинает проявляться при длительности эксперимента 12 и более недель. В экспериментах по изучению репаративного остеогенеза было показано, что имплантаты из полигидроксибутирата (ПГБ) обладают выраженными направленными остеопластическими свойствами [3, 10].
Наиболее подходящим для медицинских целей считается ПГБ, так как наиболее полно отвечает требованиям, предъявляемым к материалам биомедицинского назначения. ПГБ был получен ещё в 1926 году, но только в последнее десятилетие научный интерес к нему и вообще полимерам этого класса особенно усилился. Есть данные о том, что ПГБ обладает наибольшими тромборезистентными и биосовместимыми характеристиками среди изученных ПГА. Хорошая биосовместимость ПГБ обусловлена в первую очередь тем, что ПГБ в виде олигомеров (до 150 остатков 3-гидроксимасляной кислоты) присутствует в крови и тканях млекопитающих [8]. Свойства ПГБ позволяют широко использовать этот полимер для культивирования клеток, реконструкции тканей в хирургии, ортопедии, травматологии, создания различных имплантируемых медицинских изделий: сосудистых протезов, пародонтологических мембран, протезов для остеосинтеза и регенерации хрящевой ткани, а также для нанесения биосовместимых покрытий на другие медицинские изделия (стенты, сетчатые эндопротезы, сосудистые протезы и т.п.) [3, 10].
В работах Федорова М.Б. и соавт. [2] по исследованию и получению волокнистых и пленочных материалов на основе ПГБ подтверждена целесообразность использования именно этого полимера для нанесения оболочки на хирургические нити. Полученный шовный материал наиболее полно отвечает всем требованиям современной хирургии. Эти требования многообразны: инертность, механическая прочность, атравматичность, то есть нить не должна нарушать кровоснабжения, вызывать развитие некрозов, воспалений в ушиваемых тканях (последнее достигается стерилизацией, снижением капиллярности и приданием пролонгированных бактерицидных свойств), шовный материал не должен обладать гигроскопическими свойствами, его биодеградация должна наступать не ранее определенных сроков, обусловленных процессом заживления ран.
Однако, несмотря на большое число литературных данных, посвященных биодеградируемости ПГА, во всех случаях в течение всего срока нашего эксперимента (1 и 2 месяца) было найдено замедление процессов репарации хрящевой ткани в суставе. Вместе с этим не было обнаружено ни консолидации между ПГА и дефектом хряща, ни разрушения ПГА фагоцитами, ни макрофагальной реакции (формирование гигантских клеток инородных тел) на присутствие инородного вещества. Еще раз отмечаем, что во всех наблюдениях ПГА отсутствовал между суставными поверхностями.
После миграции ПГА в мягкие ткани (кроме случаев присутствия его в складках суставной капсулы) была найдена инкапсуляция полимера фиброзной тканью с большим число клеточных элементов. Признаков воспалительной реакции, гранулематозного воспаления и деградации ПГА во всех этих случаях также не обнаружено.
По-видимому, фрагменты ПГА, как и любые другие инородные тела в организме, активизируют процесс образования соединительной ткани, необходимой для отграничения данного инородного тела. Таким образом, имплантированный ПГА при смещении в мягкие ткани инкапсулируется соединительной тканью.
Формирование капсулы вокруг имплантированного материала обусловлено реакцией организма на инородное тело - это процесс заживления, процесс очень длительный из-за физического присутствия имплантата. ПГА, как и любое инородное тело, покрывается валом из лейкоцитов: сначала нейтрофилов и лимфоцитов, далее эти клетки, при отсутствии инфекции, заменяются моноцитами и макрофагами и постепенно туда мигрируют фибробласты, дифференцируются в фиброциты и продуцируют коллаген. Инородное тело вместе с макрофагальным валом покрывается соединительно-тканной капсулой [1, 5], то есть начинается и продолжается асептическая воспалительная реакция, индуцируемая инородным телом.
Можно отметить идентичную последовательность реакций организма на введение чужеродного материала, хотя их выраженность является величиной переменной. Первоначально стимулируется система свертывания крови и происходит активация тромбоцитов. Через несколько минут отмечают накопление лейкоцитов для нейтрализации инородного тела. Хотя фагоциты не могут быстро разрушить материал имплантата, образуется макрофагальный вал, отграничивающий имплантат от окружающих тканей. Если нет гиперрективности, фибробласты формируют гранулему и изнутри окружают имплантат соединительной тканью [5].
Ткань большинства искусственных имплантатов, даже очень плотных, активно разрушается и поглощается фагоцитами [4]. При исследовании капсулярных и перикапсулярных тканей вокруг имплантатов были найдены их частицы экстрацеллюлярно, в лизосомах гистиоцитов или в гранулемах инородных тел в окружающей фиброзно-жировой ткани [1, 7].
Можно предположить следующий патогенез изменений после введения ПГА в организм. После операции имплантат, вследствие движений животного, смещается к краю сустава и находится среди складок суставной капсулы. Из-за раздражения тканей инородным телом происходит его постепенная инкапсуляция соединительной тканью (грубоволокнистой или фиброзной). Эта капсула консолидируется с внутренней поверхностью суставной капсулы в области ее складок. Далее ПГА постепенно мигрирует через толщу суставной капсулы в окружающие мягкие ткани. Постепенно собственная капсула вокруг полимера становится все массивнее, в результате действия миофибробластов она сокращается и приводит к деформации имплантата, что также было отмечено в данной работе. Деформация имплантатов способствует их измельчению, каждый фрагмент снова инкапсулируется и становится все меньше и меньше. В конце концов эти фрагменты становятся настолько мелкими, что могут быть поглощены макрофагами и элиминированы из организма.
Считаем необходимым еще раз отметить, что инкапсуляция фрагментов ПГА фиброзной тканью без признаков его разрушения свидетельствует не в пользу биодеградируемости указанного материала, а наоборот, является доказательством его биоинертности. Материалы из ПГА ведут себя в живом организме точно так же, как и другие инородные тела: инкапсулируются соединительной тканью. Прочность поврежденных тканей после применения ПГА не только не восстанавливается, а остается сниженной (за счет дополнительной травматизации хряща полимером) в течение очень значительного промежутка времени.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы Фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект № 5.18 «Разработка технологий применения биодеградируемых полимеров на основе полигидроксиалканоатов в качестве матрицы для доставки стволовых клеток
в организм»).
Заключение
Таким образом, на основании вышеизложенного, можно заключить, что после применения ПГА деструктивные изменения в поврежденных суставах были выражены значительно сильнее, чем при естественном ходе заживления. Ни в одном случае на все сроки наблюдения ПГА не был обнаружен между суставными поверхностями. Однако иногда ПГА лежал свободно в боковых складках суставной капсулы. Значительно чаще небольшие фрагменты ПГА располагались в мягких тканях вокруг сустава, были инкапсулированы активно пролиферирующей фиброзной тканью и деформированы. Во всех случаях не было явлений макрофагальной и лейкоцитарной реакции на инородное тело и признаков развития гранулематозного воспалительного процесса. Отсутствовали и свидетельства деградации ПГА. Полученные данные указывают не на биодеградируемость, а на выраженную биоинертность используемого полимера.
Рецензенты:
Склянов Ю.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Новосибирск;
Багнетова Н.П., д.б.н., профессор, зав. лабораторией ультраструктурных исследований НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 28.06.2011.