Нейронспецифическая энолаза (NSE) представляет собой γγ-субъединицу гликолитического фермента энолазы, участвующего в превращении 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват. Фермент присутствует в клетках нейроэктодермального происхождения, нейронах головного мозга и периферической нервной ткани. NSE - специфический сывороточный маркер нейроэндокринных опухолей и клеток системы APUD [1, 4]. Клетки, положительные на нейронспецифическую энолазу (NSE+), выявляются в селезенке, пораженной опухолью нейроэктодермального или нейроэндокринного происхождения [4], но описания локализации и морфологии NSE-позитивных клеток интактной селезенки мы не нашли. Глюкокортикоиды часто используются для модуляции иммуносупрессии, но эффекты фторированных и нефторированных глюкокортикоидов отличаются. Реакция NSE-позитивных клеток селезенки на введение глюкокортикоидов и отличия в эффектах фторированных и нефторированных глюкокортикоидов изучены недостаточно.
Целью нашего исследования является изучение NSE+ клеток селезенки в норме и под влиянием глюкокортикоидов. Задачи исследования:
1) определить среднее количество NSE+ клеток в поле зрения в норме и под влиянием дексаметазона и преднизолона;
2) классифицировать морфотипы NSE+ клеток селезенки в норме;
3) изучить локализацию и количество NSE+ клеток разных морфотипов в паренхиме селезенки в норме и под влиянием дексаметазона и преднизолона;
4) выявить возможные отличия в эффектах дексаметазона и преднизолона.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служила селезёнка 60 двухмесячных мышей-самцов, массой 22-24 г, которые были разделены на группы:
1 - интактные животные (n = 15);
2 - контрольные животные, которым вводился изотонический раствор (n = 15);
3 - животные, которым вводился однократно преднизолон из расчета 13 мг/кг, что составляет 0,3 мг,(n = 15);
4 - животные, которым вводился однократно дексаметазон в дозе 0,3 мг (n = 15).
Селезёнки забирались в один день под глубоким наркозом через 1 час после инъекции во второй половине дня (14-15.00). Все экспериментальные действия проводились согласно правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (UFAW). После фиксации в 10 %-м растворе нейтрального формалина материал заливали парафином. парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовились на микротоме МПС-2, и после депарафинирования и регидратации в этаноле нисходящей концентрации срезы селезенки погружали в восстанавливающий цитратный буфер (pH 6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90-95 °С в течение 30 минут с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3 %-м раствором перикиси водорода на метаноле проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (МКАТ) к антигенному маркеру NSE (Mo a Hu Neuron-Specific Enolase, Clone BBS/NC/VI-H14), а также МКАТ к антигенному маркеру макроссиалину (Mo a Hu CD68, Clone KP1) в разведении 1:100 согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию первичных МКАТ, связавшихся с антигенами, проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase). На заключительном этапе срезы докрашивались толуидиновым синим по Нисслю. Представление о количественном распределении окрашенных клеток получали с помощью программы SigmaScan Pro 5. статистическая обработка полученных цифровых данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft office (Word и Exсel). Оценка статистической значимости производилась по t критерию Стьюдента и U критерию Вилкоксона - Манна - Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
В селезенке интактных белых беспородных мышей среднее количество NSE-позитивных (NSE+) клеток преобладает в периартериальных лимфоидных муфтах (25,6 ± 6,6). В глубоких зонах красной пульпы NSE+ клетки встречаются неравномерно: имеются участки со скоплениями клеток (53,3 ± 5,6) и участки с небольшим количеством клеток (15,6 ± 1,6). В остальных зонах селезенки количество NSE+ клеток незначительно.
В ходе цитологического исследования были выделены 5 морфотипов NSE - позитивных клеток:
1) яркие клетки полигональной формы с видимым ядром и с большим количеством крупных NSE + гранул, площадью 77,7-82 мкм2;
2) яркие округлые клетки с видимым ядром и с большим количеством мелких NSE-по-
зитивных гранул, площадью 55-75 мкм2;
3) бледные отростчатые клетки с видимым ядром и с небольшим количеством мелких NSE + гранул, площадью 58-78 мкм2 (рисунок);
4) бледные округлые клетки с видимым ядром и с большим количеством мелких NSE + гранул, площадью 9,5-19,6 мкм2;
5) мелкие яркие округлые клетки с видимым ядром и с большим количеством крупных NSE + гранул, площадью 9,2-12,6 мкм2.
Исходя из литературных данных, NSE-позитивными среди иммунокомпетентных клеток могут быть Т-лимфоциты [5, 7], тучные клетки [10], макрофаги [2], дендритные клетки [8]. NSE-позитивные безъядерные структуры нами не учитывались, так как это, вероятнее всего, тромбоциты и эритроциты [5]. По морфологическим признакам и локализации можно предположить, что клетки 1-го и 2-го типа относятся к макрофагам, либо к тучным клеткам, 3-го типа - к дендритным, а 4-го и 5-го типа, вероятно, к лимфоцитам разной степени зрелости.
В периартериальных лимфоидных муфтах селезенки интактных животных присутствуют клетки всех морфотипов, из которых больше половины составляют клетки 3-го и 4-го типов. В мантийной зоне фолликулов NSE+ клетки встречаются редко, чаще всего это клетки 4-го типа. В краевой зоне фолликулов исследуемых клеток больше, и чаще других встречаются клетки 1-го, 2-го и 3-го типов. В маргинальных синусах NSE+ клеток мало, прежде всего, это клетки 4-го типа. снаружи от маргинальных синусов выделяется пограничная зона красной пульпы. здесь обнаруживаются ряды NSE + клеток, окружающих фолликулы и синусы со стороны красной пульпы. У интактных животных здесь преобладают клетки 1-го и 5-го типов. В глубокой и периферической красной пульпе преобладают клетки 4-го типа.
У контрольных животных NSE -позитивные клетки встречаются в красной пульпе, единично в периартериальных лимфоидных муфтах и белой пульпе. Наибольшее среднее значение количества NSE + клеток в поле зрения выявляется в периферической (14,6 ± 2,0) и глубокой зонах красной пульпы (14,5 ± 1,6) селезенки.
При введении дексаметазона достоверно увеличивается количество NSE + клеток в периартериальных лимфоидных муфтах (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,01) и снижается в красной пульпе (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,005). Максимальные значения NSE + клеток в селезенке животных с введением дексаметазона наблюдаются в периферической и глубокой красной пульпе (26,6 ± 2,2 и 35,8 ± 1,9). На фоне введения преднизолона достоверно увеличивается количество изучаемых клеток в глубокой зоне красной пульпы (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,05) и в периартериальных лимфоидных муфтах (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,01). максимальные средние значения выявляются в периартериальных лимфоидных муфтах (104,4 ± 7,3), мантийной (17,3 ± 5,8) и краевой (22,6 ± 6,2) зонах лимфоидных узелков.
Более выраженный эффект преднизолона на количество NSE-позитивных клеток разных морфотипов (таблица), возможно, объясняется различным соотношением глюкокортикоидной и минералокортикоидной активности. Более благоприятным соотношением между глюкокортикоидной/противовоспалительной и минералокортикоидной активностью отличается преднизолон. Так, противовоспалительная активность преднизолона (по сравнению с таковой дексаметазона) ниже в 7 раз, при этом влияние на водно-солевой обмен более выражено. Известно, что преднизолон уменьшает общее количество и угнетает пролиферацию лимфоцитов и макрофагов селезенки [6], а дексаметазон вызывает апоптоз лимфоцитов селезенки. Однако известно, что эффекты глюкокортикоидов дозозависимы, и небольшая доза оказывает обратный эффект [9], что мы и наблюдаем в красной пульпе селезенки, где под действием дексаметазона и преднизолона количество NSE-позитивных клеток всех типов увеличивается. Нами отмечено увеличение количества делящихся клеток в красной пульпе селезенки опытных животных. В лимфоидных узелках под влиянием преднизолона наблюдается снижение количества всех за исключением 1-го типов NSE-позитивных клеток в мантийной зоне и увеличение в краевой зоне. не было зафиксировано усиление
пролиферации.
Изменение количества NSE-позитивных клеток в разных зонах селезенки под влиянием глюкокортикоидов
|
ПАЛМ |
МЗФ |
КЗФ |
МС |
ПЗКП |
ПКП |
ГКП |
||||||||||||||||
|
морфотипы |
К |
Д |
П |
К |
Д |
П |
К |
Д |
П |
К |
Д |
П |
К |
Д |
П |
К |
Д |
П |
К |
Д |
П |
|
|
1 |
0,6 |
1 ≈ |
71* |
4,4 |
2,6 |
11,8 |
1,3 |
1,6** |
11,6** |
2,9 |
1,4 |
1,1** |
1,5 |
0,8 |
1,4 |
2,8 |
4,4** |
12,4* |
3,1 |
8,2* |
4,4* |
|
|
2 |
0,4 |
0,2 |
8,8* |
2,3 |
1,2 |
1,4* |
0,4 |
1,4 |
2,7** |
0,3 |
2,2 |
1* |
0,4 |
0,2 |
1,4 |
0,3 |
7,8* |
9,4* |
1,9 |
8,4* |
4,2* |
|
|
3 |
0,1 |
0,4 |
6* |
1,6 |
1,4 |
1,2* |
0,4 |
2,4* |
2,7* |
0,1 |
1 |
1,2* |
0,4 |
0,8 |
2,2 |
1,9 |
3,8 |
8,2* |
3,8 |
3,8* |
4,2 |
|
|
4 |
1,4 |
2,6 ≈ |
7,4* |
3 |
3,6 |
1,5* |
1,3 |
2,2 |
2,9* |
2 |
2,2 |
1** |
1,4 |
0,8 |
2,4** |
6,6 |
6,2 |
8,8 |
2,3 |
7,2** |
5,8** |
|
|
5 |
0,6 |
1 |
11,2* |
4,4 |
2,6 |
1,4* |
1,3 |
1,6 |
2,7* |
2,9 |
1,4 |
1* |
1,5 |
0,8 |
1,4 |
2,8 |
4,4* |
9,4* |
3,1 |
8,2* |
4,2 ≈ |
|
Примечание: к - контрольная группа животных, Д - животные с введением дексаметазона, П - животные с введением преднизолона; * - достоверность по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни P < 0,05; ** - достоверность по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни P < 0,01; ≈- достоверность по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни P < 0,005.
Преднизолон увеличивает количество NSE-позитивных клеток в периартериальных лимфоидных муфтах (см. рисунок). увеличение количества NSE-позитивных клеток в краевой зоне лимфоидного узелка под влиянием преднизолона, возможно, объясняется миграцией исследуемых клеток из кровяного русла. аналогичное увеличение исследуемых клеток в красной пульпе под влиянием дексаметазона и преднизолона, очевидно, связано со стимуляцией пролиферации.
Выводы
1. Воздействие дексаметазона приводит к достоверному увеличению NSE-позитивных клеток в красной пульпе, а воздействие преднизолона - в периартериальных лимфоидных муфтах, в лимфоидных узелках, пограничных и глубоких зонах красной пульпы.
2. NSE-позитивные клетки классифицируются по площади клетки, количеству и размеру гранул на 5 морфотипов.
3. Морфотипы NSE-позитивных клеток отличаются локализацией и количественной реакцией на глюкокортикоиды.
4. Выявлено, что преднизолон стимулирует миграцию NSE-позитивных клеток из кровяного русла и пролиферацию исследуемых клеток в красной пульпе селезенки, дексаметазон активизирует только пролиферацию исследуемых клеток в красной пульпе селезенки.
а
б
в
г
Иммунологическая реакция Mo a Hu NSE. Распределение NSE + клеток в разных зонах селезенки
А - контрольных животных, Б - животных с введением дексаметазона,
В - животных с введением преднизолона:
1 - ПАЛМ (периартериальная лимфатическая муфта), 2 - МЗФ (мантийная зона фолликула), 3 - КЗФ (краевая зона фолликула), 4 - МС (маргинальный синус), 5 - ПЗКП (перифолликулярная зона красной пульпы), 6 - ГКП (глубокая зона красной пульпы. Микмед-5 10×10. Распределение NSE-позитивных клеток разных морфотипов в глубокой красной пульпе селезенки интактного животного: а - NSE +клетки 2-го типа , б - NSE +клетки 3-го типа