Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

THE GLUCOCORTICOIDS EFFECT ON THE NSE-POSITIVE CELLS MORHPOTYPES OF THE SPLEEN

Luzikova E.М. 1 Sergeeva V.E. 1 Kirillova O.N. 1 Skvorcova M.M. 1 Ivanova K.O. 1
1 FGOU VPO «Chuvash State University I.N. Ulyanov», Cheboksary
1037 KB
The aim of our research was to study the effects of prednisolone and dexametasone on the quantitative and morphological characteristics of NSE- positive cells in different functional zones of the spleen. During the morphometrical research we set up five morphotypes of NSE+-cells. The cells of the different morhpotypes characterized localization and quantification of response to glucocorticoids. Revealed that prednisolone stimulates migration of NSE-positive cells from the bloodstream and proliferation of cells studied in the red pulp of the spleen, dexamethasone activates only the proliferative-talkie studied cells in the red pulp of the spleen.
spleen
prednisolone
neuron specific еnolase
NSE-positive cells

Нейронспецифическая энолаза (NSE) представляет собой γγ-субъединицу гликолитического фермента энолазы, участвующего в превращении 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват. Фермент присутствует в клетках нейроэктодермального происхождения, нейронах головного мозга и периферической нервной ткани. NSE - специфический сывороточный маркер нейроэндокринных опухолей и клеток системы APUD [1, 4]. Клетки, положительные на нейронспецифическую энолазу (NSE+), выявляются в селезенке, пораженной опухолью нейроэктодермального или нейроэндокринного происхождения [4], но описания локализации и морфологии NSE-позитивных клеток интактной селезенки мы не нашли. Глюкокортикоиды часто используются для модуляции иммуносупрессии, но эффекты фторированных и нефторированных глюкокортикоидов отличаются. Реакция NSE-позитивных клеток селезенки на введение глюкокортикоидов и отличия в эффектах фторированных и нефторированных глюкокортикоидов изучены недостаточно.

Целью нашего исследования является изучение NSE+ клеток селезенки в норме и под влиянием глюкокортикоидов. Задачи исследования:

1) определить среднее количество NSE+ клеток в поле зрения в норме и под влиянием дексаметазона и преднизолона;

2) классифицировать морфотипы NSE+ клеток селезенки в норме;

3) изучить локализацию и количество NSE+ клеток разных морфотипов в паренхиме селезенки в норме и под влиянием дексаметазона и преднизолона;

4) выявить возможные отличия в эффектах дексаметазона и преднизолона.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служила селезёнка 60 двухмесячных мышей-самцов, массой 22-24 г, которые были разделены на группы:

1 - интактные животные (n = 15);

2 - контрольные животные, которым вводился изотонический раствор (n = 15);

3 - животные, которым вводился однократно преднизолон из расчета 13 мг/кг, что составляет 0,3 мг,(n = 15);

4 - животные, которым вводился однократно дексаметазон в дозе 0,3 мг (n = 15).

Селезёнки забирались в один день под глубоким наркозом через 1 час после инъекции во второй половине дня (14-15.00). Все экспериментальные действия проводились согласно правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (UFAW). После фиксации в 10 %-м растворе нейтрального формалина материал заливали парафином. парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовились на микротоме МПС-2, и после депарафинирования и регидратации в этаноле нисходящей концентрации срезы селезенки погружали в восстанавливающий цитратный буфер (pH 6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90-95 °С в течение 30 минут с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3 %-м раствором перикиси водорода на метаноле проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (МКАТ) к антигенному маркеру NSE (Mo a Hu Neuron-Specific Enolase, Clone BBS/NC/VI-H14), а также МКАТ к антигенному маркеру макроссиалину (Mo a Hu CD68, Clone KP1) в разведении 1:100 согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию первичных МКАТ, связавшихся с антигенами, проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase). На заключительном этапе срезы докрашивались толуидиновым синим по Нисслю. Представление о количественном распределении окрашенных клеток получали с помощью программы SigmaScan Pro 5. статистическая обработка полученных цифровых данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft office (Word и Exсel). Оценка статистической значимости производилась по t критерию Стьюдента и U критерию Вилкоксона - Манна - Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

В селезенке интактных белых беспородных мышей среднее количество NSE-позитивных (NSE+) клеток преобладает в периартериальных лимфоидных муфтах (25,6 ± 6,6). В глубоких зонах красной пульпы NSE+ клетки встречаются неравномерно: имеются участки со скоплениями клеток (53,3 ± 5,6) и участки с небольшим количеством клеток (15,6 ± 1,6). В остальных зонах селезенки количество NSE+ клеток незначительно.

В ходе цитологического исследования были выделены 5 морфотипов NSE - позитивных клеток:

1) яркие клетки полигональной формы с видимым ядром и с большим количеством крупных NSE + гранул, площадью 77,7-82 мкм2;

2) яркие округлые клетки с видимым ядром и с большим количеством мелких NSE-по-
зитивных гранул, площадью 55-75 мкм2;

3) бледные отростчатые клетки с видимым ядром и с небольшим количеством мелких NSE + гранул, площадью 58-78 мкм2 (рисунок);

4) бледные округлые клетки с видимым ядром и с большим количеством мелких NSE + гранул, площадью 9,5-19,6 мкм2;

5) мелкие яркие округлые клетки с видимым ядром и с большим количеством крупных NSE + гранул, площадью 9,2-12,6 мкм2.

Исходя из литературных данных, NSE-позитивными среди иммунокомпетентных клеток могут быть Т-лимфоциты [5, 7], тучные клетки [10], макрофаги [2], дендритные клетки [8]. NSE-позитивные безъядерные структуры нами не учитывались, так как это, вероятнее всего, тромбоциты и эритроциты [5]. По морфологическим признакам и локализации можно предположить, что клетки 1-го и 2-го типа относятся к макрофагам, либо к тучным клеткам, 3-го типа - к дендритным, а 4-го и 5-го типа, вероятно, к лимфоцитам разной степени зрелости.

В периартериальных лимфоидных муфтах селезенки интактных животных присутствуют клетки всех морфотипов, из которых больше половины составляют клетки 3-го и 4-го типов. В мантийной зоне фолликулов NSE+ клетки встречаются редко, чаще всего это клетки 4-го типа. В краевой зоне фолликулов исследуемых клеток больше, и чаще других встречаются клетки 1-го, 2-го и 3-го типов. В маргинальных синусах NSE+ клеток мало, прежде всего, это клетки 4-го типа. снаружи от маргинальных синусов выделяется пограничная зона красной пульпы. здесь обнаруживаются ряды NSE + клеток, окружающих фолликулы и синусы со стороны красной пульпы. У интактных животных здесь преобладают клетки 1-го и 5-го типов. В глубокой и периферической красной пульпе преобладают клетки 4-го типа.

У контрольных животных NSE -позитивные клетки встречаются в красной пульпе, единично в периартериальных лимфоидных муфтах и белой пульпе. Наибольшее среднее значение количества NSE + клеток в поле зрения выявляется в периферической (14,6 ± 2,0) и глубокой зонах красной пульпы (14,5 ± 1,6) селезенки.

При введении дексаметазона достоверно увеличивается количество NSE + клеток в периартериальных лимфоидных муфтах (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,01) и снижается в красной пульпе (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,005). Максимальные значения NSE + клеток в селезенке животных с введением дексаметазона наблюдаются в периферической и глубокой красной пульпе (26,6 ± 2,2 и 35,8 ± 1,9). На фоне введения преднизолона достоверно увеличивается количество изучаемых клеток в глубокой зоне красной пульпы (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,05) и в периартериальных лимфоидных муфтах (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни P < 0,01). максимальные средние значения выявляются в периартериальных лимфоидных муфтах (104,4 ± 7,3), мантийной (17,3 ± 5,8) и краевой (22,6 ± 6,2) зонах лимфоидных узелков.

Более выраженный эффект преднизолона на количество NSE-позитивных клеток разных морфотипов (таблица), возможно, объясняется различным соотношением глюкокортикоидной и минералокортикоидной активности. Более благоприятным соотношением между глюкокортикоидной/противовоспалительной и минералокортикоидной активностью отличается преднизолон. Так, противовоспалительная активность преднизолона (по сравнению с таковой дексаметазона) ниже в 7 раз, при этом влияние на водно-солевой обмен более выражено. Известно, что преднизолон уменьшает общее количество и угнетает пролиферацию лимфоцитов и макрофагов селезенки [6], а дексаметазон вызывает апоптоз лимфоцитов селезенки. Однако известно, что эффекты глюкокортикоидов дозозависимы, и небольшая доза оказывает обратный эффект [9], что мы и наблюдаем в красной пульпе селезенки, где под действием дексаметазона и преднизолона количество NSE-позитивных клеток всех типов увеличивается. Нами отмечено увеличение количества делящихся клеток в красной пульпе селезенки опытных животных. В лимфоидных узелках под влиянием преднизолона наблюдается снижение количества всех за исключением 1-го типов NSE-позитивных клеток в мантийной зоне и увеличение в краевой зоне. не было зафиксировано усиление
пролиферации.

Изменение количества NSE-позитивных клеток в разных зонах селезенки под влиянием глюкокортикоидов

 

ПАЛМ

МЗФ

КЗФ

МС

ПЗКП

ПКП

ГКП

морфотипы

 

К

Д

П

К

Д

П

К

Д

П

К

Д

П

К

Д

П

К

Д

П

К

Д

П

1

0,6

1 ≈

71*

4,4

2,6

11,8

1,3

1,6**

11,6**

2,9

1,4

1,1**

1,5

0,8

1,4

2,8

4,4**

12,4*

3,1

8,2*

4,4*

2

0,4

0,2

8,8*

2,3

1,2

1,4*

0,4

1,4

2,7**

0,3

2,2

1*

0,4

0,2

1,4

0,3

7,8*

9,4*

1,9

8,4*

4,2*

3

0,1

0,4

6*

1,6

1,4

1,2*

0,4

2,4*

2,7*

0,1

1

1,2*

0,4

0,8

2,2

1,9

3,8

8,2*

3,8

3,8*

4,2

4

1,4

2,6 ≈

7,4*

3

3,6

1,5*

1,3

2,2

2,9*

2

2,2

1**

1,4

0,8

2,4**

6,6

6,2

8,8

2,3

7,2**

5,8**

5

0,6

1

11,2*

4,4

2,6

1,4*

1,3

1,6

2,7*

2,9

1,4

1*

1,5

0,8

1,4

2,8

4,4*

9,4*

3,1

8,2*

4,2 ≈

Примечание: к - контрольная группа животных, Д - животные с введением дексаметазона, П - животные с введением преднизолона; * - достоверность по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни P < 0,05; ** - достоверность по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни P < 0,01; ≈- достоверность по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни P < 0,005.

Преднизолон увеличивает количество NSE-позитивных клеток в периартериальных лимфоидных муфтах (см. рисунок). увеличение количества NSE-позитивных клеток в краевой зоне лимфоидного узелка под влиянием преднизолона, возможно, объясняется миграцией исследуемых клеток из кровяного русла. аналогичное увеличение исследуемых клеток в красной пульпе под влиянием дексаметазона и преднизолона, очевидно, связано со стимуляцией пролиферации.

Выводы

1. Воздействие дексаметазона приводит к достоверному увеличению NSE-позитивных клеток в красной пульпе, а воздействие преднизолона - в периартериальных лимфоидных муфтах, в лимфоидных узелках, пограничных и глубоких зонах красной пульпы.

2. NSE-позитивные клетки классифицируются по площади клетки, количеству и размеру гранул на 5 морфотипов.

3. Морфотипы NSE-позитивных клеток отличаются локализацией и количественной реакцией на глюкокортикоиды.

4. Выявлено, что преднизолон стимулирует миграцию NSE-позитивных клеток из кровяного русла и пролиферацию исследуемых клеток в красной пульпе селезенки, дексаметазон активизирует только пролиферацию исследуемых клеток в красной пульпе селезенки.

pic

а

pic

б

pic

в

pic

г

Иммунологическая реакция Mo a Hu NSE. Распределение NSE + клеток в разных зонах селезенки
А - контрольных животных, Б - животных с введением дексаметазона,
В - животных с введением преднизолона:
1 - ПАЛМ (периартериальная лимфатическая муфта), 2 - МЗФ (мантийная зона фолликула), 3 - КЗФ (краевая зона фолликула), 4 - МС (маргинальный синус), 5 - ПЗКП (перифолликулярная зона красной пульпы), 6 - ГКП (глубокая зона красной пульпы. Микмед-5 10×10. Распределение NSE-позитивных клеток разных морфотипов в глубокой красной пульпе селезенки интактного животного: а - NSE +клетки 2-го типа , б - NSE +клетки 3-го типа