Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,798
COMPARATIVE EVALUATION OF METHODS FOR DETECT OF APOPTOTIC ACTIVITY BONE MARROW CELLS AT PATIENTS WITH CHRONIC MYELOGENOUS LEUKEMIA (FLUORESCENCE MICROSCOPY AND FLOW CYTOMETRY)
Апоптоз представляет собой процесс физиологической клеточной смерти, который контролируется генетически и присущ всем клеткам человека [8]. Понимание молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию апоптоза, способствует выяснению нарушений процессов клеточного роста при различных заболеваниях [7]. Факторы, вовлеченные в регуляцию процесса апоптоза, в настоящее время рассматриваются в качестве основных клеточных мишеней целенаправленной терапии в онкогематологии, а изучение характера апоптотических реакций под ее воздействием может служить лабораторным маркером эффективности и помогать в выборе рациональной химиотерапии [3]. Для качественного и количественного определения направленности апоптотических реакций в клетке был предложен ряд методов, позволивших раскрыть многие механизмы, лежащие в основе апоптотической и некротической клеточной смерти.
Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка результатов измерения апоптоза в клетках костного мозга больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в условиях индукции двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией.
Материалы и методы исследования
Исследование было проведено на гетерогенной популяции клеток костного мозга (КМ) у больных ХМЛ в хронической фазе (ХФ) (n = 14) - первая группа и в фазе бластного криза (БК) (n = 6) - вторая группа. У больных 1-й группы был получен полный гематологический ответ и полный или частичный цитогенетический ответ на терапию гливеком. Больные 2-й группы были включены в исследование до начала терапии гливеком. Разделение на группы было проведено на основе цитогенетических и клинико-гематологических данных согласно критериям European Leukemia Net [2].
На момент обследования у больных 1-й группы количество бластных клеток в КМ составило не более 1,2 ± 0,7 %, а у больных 2-й группы - 47,1 ± 11,9 %. Количество клеток с Ph(+) хромосомой у больных 1-й группы было в пределах 0-26 %. У больных 2-й группы Ph(+) хромосома определялась в 100 %.
1. Выделение клеток костного мозга
Клетки КМ были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколл-верографин с относительной плотностью 1,077 г/мл из 2 мл гепаринизированного костномозгового пунктата, полученного при стернальной пункции. После центрифугирования (40 минут при 1500 об./мин) отделяли клеточную фракцию, которую трижды отмывали раствором хлорида натрия 9 г/л. Выделенные клетки суспендировали в среде следующего состава (ммоль/л): NaCl - 119; KCl - 4,69; CaCl2 - 2,52; MgCl2 - 1,18; глюкоза - 5,5; KH2PO4 - 1,18; HEPES - 25; pH = 7,4 с добавлением 60 г/л раствора ЭДТА в соотношении 1/20 от объема костного мозга из расчета 1 мл раствора на 106 клеток.
На каждом этапе выделения клеток подсчитывали их количество в камере Горяева и определяли жизнеспособность по связыванию трипанового синего. Жизнеспособные клетки составляли в среднем 92-99 % от их общего числа.
2. Оценка апоптоза
Интенсивность апоптотических реакций в клетках КМ оценивали двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией.
2.1. Флуоресцентная микроскопия
Интенсивность реакций апоптоза оценивали по количеству клеток, связавших акридин оранж (АО) [1]. На предметное стекло помещали 5 мкл клеточной суспензии, содержащей клетки КМ, смешивали с равным объемом раствора АО (100 мкг/мл), затем накрывали покровным стеклом и просматривали под масляной иммерсией (Микроскоп Leica DM4000B, светофильтр H3). Изображение фиксировали с помощью видеосистемы на основе цифровой камеры. Подсчитывали не менее 100 клеток в разных полях зрения. Количество клеток, связавших АО (АО+ клетки), выражали в процентах от общего числа.
2.2. Проточная цитометрия
Интенсивность реакций апоптоза оценивали по связыванию клетками КМ двух маркеров - аннексина V и пропидий йодида (PI) с помощью набора реактивов ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I
(«BD PharmingemTM», США). Результаты выражали в процентах от общего числа клеток. Аннексин V применяли для выявления клеток, вступивших в апоптоз (аннексин V+ клетки). Пропидий йодид (PI) употребляли в качестве маркера жизнеспособности клеток (аннексин V-PI- клетки) и клеточного некроза (аннексин V- PI+ клетки). В каждом образце анализировали 10000 клеток. Мононуклеарные клетки костного мозга идентифицировали на основе CD45 флюоресценции. Анализировали недифференцированный клеточный пул по общему лейкоцитарному маркеру CD34 (CD34+ клетки).
3. Индукция апоптоза
Об апоптотической активности клеток КМ судили по разнице в количестве клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза. Для оценки спонтанного апоптоза 4∙106 клеток инкубировали в 1 мл инкубационной среды. Индукцию апоптоза вызывали дефицитом глюкозы в среде инкубации, помещая то же количество клеток в минимальный объем среды (50 мкл). Количество клеток в состоянии апоптоза определяли после 18-часовой инкубации при температуре +37 °С.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0. Сравнение было проведено с использованием непараметрического метода Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
При изучении клеток в условиях флуоресцентной микроскопии учитывали следующие признаки: размеры ядра, характер распределения хроматина, наличие хроматиновых тел в цитоплазме, характер свечения ДНК. Акридинсвязывающая способность клеток была изучена во всех образцах КМ больных, включенных в 1-ю и 2-ю группы. Полученные данные представлены в табл. 1, из которой видно, что уровень спонтанного апоптоза и индуцированного в клетках КМ у больных ХМЛ в 1-й группе намного выше, чем у больных 2-й группы. Прирост количества АО+ клеток КМ в условиях индукции апоптоза в 1-й группе более чем в 10 раз превышает их прирост во 2-й группе (9,5 и 0,7 % соответственно).
Таблица 1
Связывание акридин оранжа клетками костного мозга
при спонтанном и индуцированном апоптозе
|
Группы |
Количество клеток костного мозга связывающих АО, % |
||
|
Спонтанный апоптоз |
Индуцированный апоптоз |
Прирост клеток в условиях индукции |
|
|
1-я группа |
10,9 ± 1,0* |
20,4 ± 1,3*, ** |
9,5 ± 0,9* |
|
2-я группа |
3,8 ± 0,9 |
4,5 ± 0,8** |
0,7 ± 0,4 |
Примечания:
* - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со 2-й группой;
** - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со спонтанным апоптозом.
Представленные данные указывают на то, что клетки КМ у больных в фазе БК характеризуются низкой апоптотической активностью и способностью вступать в апоптоз в условиях его индукции.
Способность клеток КМ вступать в апоптоз в условиях индукции у больных ХМЛ в ХФ и фазе БК была оценена путем параллельного измерения числа клеток КМ в апоптозе методом проточной
цитометрии.
Поскольку целью исследования была сравнительная оценка методов, характеризующих апоптоз в клетках КМ, при проточной цитометрии направленно анализировали общеклеточный пул (недифференцированный клеточный пул). Способность клеток связывать аннексин V и пропидий йодид была изучена во всех образцах КМ больных, включенных в 1-ю и 2-ю группы. Полученные данные представлены в табл. 2. В 1-й группе количество аннексин V+ связывающих клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза равнялось 14,2 и 23,6 % (прирост - 9,8). Во 2-й группе количество аннексин V+ клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза составляло 4,2 и 4,8 % соответственно. Прирост числа клеток в состоянии апоптоза составил 0,6 %.
Таблица 2
Связывание аннексина V клетками костного мозга больных 1-й и 2-й групп
при спонтанном и индуцированном апоптозе
|
Группы |
Количество аннексин V+ клеток, ( %) |
||
|
Спонтанный апоптоз |
Индуцированный апоптоз |
Прирост клеток |
|
|
1-я группа |
14,2 ± 2,0* |
24,0 ± 2,8*, ** |
9,8 ± 0,9* |
|
2-я группа |
4,2 ± 0,6 |
4,8 ± 0,8** |
0,6 ± 0,4 |
Примечания:
* - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со 2-й группой;
** - достоверность различий p < 0,005 по сравнению со спонтанным апоптозом.
Как следует из табл. 2, уровень спонтанного и индуцированного апоптоза в клетках КМ, а также прирост количества клеток в условиях индукции у больных 1-й группы значительно выше соответствующих показателей 2-й группы.
Сравнительную оценку результатов, полученных методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, провели на основании того, что клетки для изучения процессов апоптоза в КМ для обоих методов отбирали из одних и тех же образов клеточной суспензии.
Аналитическую надёжность методов оценивали, сравнивая количество клеток с признаками апоптоза: АО+ клетки и аннексин V+ клетки. В табл. 3 представлены значения коэффициента корреляции (r) при сопоставлении результатов, полученных методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.
Значения коэффициента корреляции (r) указывают на возможность сравнения результатов, полученных при флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии по количеству клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза.
Вопрос оценки способности клеток к апоптозу при различных заболеваниях остается актуальным для решения многих проблем теоретической и практической медицины, в том числе онкогематологии [4]. Изучение процессов апоптоза на клеточных культурах с помощью набора классических биохимических, микроскопических и более современных методов - проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции, позволило выявить ряд принципиальных аспектов, касающихся вовлечения апоптоза в процессы гибели опухолевых клеток.
Таблица 3
Значения коэффициента корреляции (r)
при сопоставлении результатов, полученных при определении апоптоза методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии
|
Сравниваемые показатели |
Апоптоз |
|
|
Спонтанный |
Индуцированный |
|
|
Количество АО+ клеток, % и аннексин V+ клеток, % |
0,84 |
0,94 |
Примечание. * - критерий достоверности р < 0,05.
Методы с использованием красителя АО - флуорохрома с характерными максимумами флуоресценции в области 530 нм и 640 нм продолжают с успехом применяться для выявления характера апоптотических изменений в различных клетках. Полагают, что данный краситель при встраивании в молекулу ДНК способствует выявлению апоптотических клеток по характерному яркому желто-зеленому свечению ядра. Жизнеспособные клетки обладают диффузной зеленой флуоресценцией. Клетки, подвергшиеся некрозу, характеризуются выраженным красно-оранжевым свечением [5]. Достоинством примененного нами варианта микроскопического метода является простота и невысокая стоимость реактивов, возможность оценки состояния ДНК по характеру свечения и достаточно четких признаков, подтверждающих факт необратимого вступления клетки в процесс апоптоза. Применение профессионального лабораторного микроскопа Leica DM4000B, оснащенного видеосистемой, позволило нам избежать субъективизма в оценке микроскопической картины, характерного для визуальной оценки.
Метод проточной цитометрии с использованием рекомбинантного аннексина V - белка, конъюгированного с флуорохромом, служит одним из наиболее быстрых и эффективных методов обнаружения апоптотических клеток [6]. При использовании дополнительного красителя - пропидий иодида (PI), метод позволяет одновременно определять интактные клетки, клетки, находящиеся в апоптозе и клетки в состоянии некроза.
К достоинствам данного метода относятся: возможность более раннего обнаружения инициации апоптоза в клетке, подсчет большего количества клеток, надежная стандартизация метода за счет наличия промышленно выпускаемых тест-систем и сертифицированных контрольных материалов.
Таким образом, полученные нами данные указывают на сопоставимость результатов оценки апоптотических реакций в клетках костного мозга. Вполне очевидно, что в клинической практике для изучения направленности апоптотических реакций в клетках предпочтение следует отдавать проточной цитометрии вследствие высокой стандартизации метода. В экспериментальных исследованиях микроскопический метод, использующий не только акридиновый оранжевый, но и другие флуоресцирующие красители, сохраняют свою актуальность.
Рецензенты:
Максимов А.Г., д.м.н., доцент, доцент кафедры факультетской терапии ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны РФ, г. Санкт-Петербург;
Богданов А.Н., д.м.н., профессор, профессор кафедры терапии и ревматологии им. Э.Э. Эйхвальда Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, г. Санкт-Петербург.
Работа поступила в редакцию 07.07.2011.
Библиографическая ссылка
Бессмельцев С.С., Козлов А.В., Сясина Т.В., Удальева В.Ю. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ (ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ) // Фундаментальные исследования. 2011. № 10-1. С. 33-36;URL: https://fundamental-research.ru/en/article/view?id=28665 (дата обращения: 20.06.2026).