Активные формы кислорода (АФК) образуются как в процессе нормального аэробного клеточного метаболизма, так и в результате воздействия ряда факторов окружающей среды, таких как ионизирующее и УФ-излучения, тепло, канцерогены и др. С одной стороны, АФК, образующиеся в клетках и межклеточном пространстве, могут вызывать повреждения биологических структур ДНК, белков, липидов и др., а с другой, они выполняют сигнальную функцию, направленную на нейтрализацию окислительного стресса, обусловленного АФК [7]. Во всех живых организмах существуют системы антиоксидантной защиты клеток, предохраняющие их от избыточного содержания АФК, представленные специализированными ферментами и низкомолекулярными антиоксидантами. Способность снижать концентрацию АФК обусловлена их реакцией с легко окисляемыми группами антиоксидантов. Ранее было установлено, что среди природных пуриновых соединений - гуанозин (Guo), инозин (Ino) и гуанозин-5-монофосфат (ГМФ) обладают ярко выраженными антиоксидантными и радиозащитными свойствами [1, 8, 6]. В данной работе исследованы антиоксидантные свойства ксантозина (Xao), который представляет собой природный продукт катаболизма пуринов.
Цель исследования: с помощью различных тест-систем изучить антиоксидантные свойства ксантозина.
Материалы и методы исследования
Воздействие ионизирующего излучения
Облучение проводили на рентгеновской терапевтической установке РУТ-15 (Мосрентген, Россия) в дозе 7 Гр (1 Гр/мин, фокусное расстояние 37,5 см, ток 20 мА, напряжение 200 кВ) или 4,5 Гр/мин (для иммуноферментного анализа) фокусное расстояние 19,5 см, ток 20 мА, напряжение 200 кВ).
Определение перекиси водорода
Для количественного определения Н2О2 использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол - 4-йодфенол - пероксидаза. Ксантозин в концентрациях 0,02; 0,05; 0,1; 1 мМ в фосфатном буфере (1 мМ, рН 7,4) подвергали воздействию рентгеновского излучения в стеклянных флаконах (Beckman, США). Интенсивность хемилюминесценции измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Бета-1 («Медаппаратура», Украина). Калибровку измерений осуществляли с помощью Н2О2 известной концентрации [5].
Определение гидроксильных радикалов
Гидроксильные радикалы (ОН-радикалы) определяли с помощью специфического флуоресцентного зонда, кумарин-3-карбоновой кислоты, как описано ранее [6]. Xao в концентрациях 0,02; 0,05; 0,1; 1 мМ в 1 мМ в фосфатном буфере, рН 7,4, облучали рентгеновским излучением в стеклянных флаконах. Интенсивность флуоресценции проб измеряли на спектрофлуориметре SFM 25A («Kontron Instruments», Италия) при λ = 400 нм и λ = 450 нм в зеркальной кварцевой кювете при комнатной температуре. Для калибровки результатов образования ОН-радикалов использовали растворы аутентичного препарата 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты известной концентрации [4].
Иммуноферментный анализ
Детальное описание использованного метода иммуноферментного анализа опубликовано ранее [7]. Ксантозин в концентрациях 0,02; 0,05; 0,1; 1 мМ в растворе ДНК облучали рентгеновским излучением в пробирках (Eppendorf, Germany). Содержание 8-оксогуанина определяли на основании известной величины его радиационно-химического выхода в ДНК.
Животные
В экспериментах использовались 6-недельные самцы белых мышей (Kv:SHK) (18-20 г). Все экспериментальные протоколы получили одобрение комитета по биоэтике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
Микроядерный тест
Xao вводили мышам внутрибрюшинно (45 мкг/г в 0,14 М NaCl) за 15 мин до и через 15 мин после облучения в дозе 1,5 Гр. Данная величина дозы была выбрана как наиболее оптимальная, так как линейная зависимость «доза-эффект» для мышей Kv:SHK при образовании МЯ в ПХЭ проявляется в диапазоне доз 0-1,5 Гр [2]. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 24 ч после облучения, поскольку максимальный выход ПХЭ с МЯ наблюдается примерно через сутки после воздействия ионизирующей радиации. Процедуры, связанные с изготовлением и окрашиванием гистологических препаратов, описаны ранее [1]. Подсчет ПХЭ, содержащих МЯ, осуществляли с помощью светового микроскопа ЛОМО «МикМед-2» (Россия) с иммерсионным объективом при увеличении ×1000. Анализировали данные для 5 особей на одну экспериментальную точку, c подсчетом не менее 2000 ПХЭ
на мышь.
Результаты исследования и их обсуждение
Известно, что АФК образуются при радиолизе воды под действием ионизирующего излучения. Наиболее долгоживущей разновидностью АФК является Н2О2, которая может оказывать как повреждающее действие на различные клеточные структуры, так и играть сигнально-регуляторную роль, связанную с активацией процессов восстановления повреждений или апоптоза [3]. Количество образовавшейся Н2О2 линейно зависит от поглощенной дозы в диапазоне 1-7 Гр. Исследовано влияние Xao в концентрациях 0,02; 0,05; 0,1 и 1 мМ на образование Н2О2 в фосфатном буфере под воздействием рентгеновского излучения в дозе 7 Гр (табл. 1). Доза 7 Гр является летальной для большинства млекопитающих. Как видно из результатов табл. 1, Xao уменьшает индуцированное рентгеновским излучением образование Н2О2 в растворе при увеличении его концентрации до 1 мМ в 3,9 раза. Гидроксильные радикалы являются наиболее реакционно-способной разновидностью АФК и приводят к окислительным повреждениям биологических макромолекул. Исследовано влияние Xao на образование ОН-радикалов в фосфатном буфере под действием рентгеновского излучения в дозе 7 Гр (табл. 1) с использованием специфичного для ОН-радикалов флуоресцентного зонда - кумарин-3-карбоновой кислоты. В диапазоне доз 1-7 Гр наблюдается линейная зависимость эффекта от величины дозы. Xao в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ снижает генерацию ОН-радикалов в три раза.
Таблица 1
Влияние ксантозина в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ на генерацию перекиси водорода, гидроксильных радикалов в фосфатном буфере (1 мМ; рН 7,4) и образование 8-ОГ в растворе ДНК, облученных в дозе 7 Гр. ФИД - фактор изменения дозы. Данные представлены как средние значения и их ошибки по трем независимым экспериментам
|
Воздействие |
H2O2, мкМ |
ФИД |
OH-радикалы, мкМ |
ФИД |
8-ОГ на 105 гуанинов |
ФИД |
|
7 Гр |
0,59± ± 0,07 |
- |
1,78± ± 0,02 |
- |
5,5± ± 0,3 |
- |
|
7 Гр + Xao 0,02 мМ |
0,37± ± 0,05* |
1,6 |
1,62± ± 0,02* |
1,1 |
4,5± ± 0,3* |
1,2 |
|
7 Гр + Xao 0,05 мМ |
0,29± ± 0,03* |
2,0 |
1,53± ± 0,01* |
1,2 |
3,4± ± 0,2* |
1,6 |
|
7 Гр + Xao 0,1 мМ |
0,26± ± 0,06* |
2,3 |
1,36± ± 0,01* |
1,3 |
2,6± ± 0.2* |
2,1 |
|
7 Гр + Xao 1 мМ |
0,15± ± 0,04* |
3,9 |
0,60± ± 0,01* |
3,0 |
2,1± ± 0.1* |
2,6 |
Примечание: * - р < 0,05 относительно контроля (7 Гр) по критерию Стьюдента.
Известно, что окисление гуанина в ДНК приводит к образованию 8-ОГ, который является ключевым биомаркером повреждения ДНК АФК в процессе радиолиза ДНК. С помощью иммуноферментного анализа, с применением специфических к 8-ОГ антител исследовано влияние Xao на образование 8-ОГ в ДНК под действием рентгеновского излучения в дозе 7 Гр. Как показано в табл. 1, Xao в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ снижает радиационно-индуцированное образование 8-ОГ в 2,6 раза. Добавление Xao к необлученной ДНК не влияет на увеличение образования 8-ОГ, из чего следует, что ксантозин не вступает в кросс-реакцию с первичными антителами.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что Xao способен снижать радиационно-индуцированную генерацию перекиси водорода, ОН-радикалов в водных растворах и образование 8-ОГ в ДНК in vitro (см. табл. 1). Наши данные согласуются с ранее опубликованными результатами по другим природным пуриновым соединениям. Ранее показано, что Guo, Ino [1] и ГМФ [6] проявляют антиоксидантные свойства. Xao более эффективно, по сравнению с Guo, Ino и ГМФ, уменьшает образование Н2О2 и ОН-радикалов в водном растворе в концентрации 1 мМ. Антиоксидантная способность по этим тестам увеличивается к ряду Xao > ГМФ > Guo > Ino. Однако в случае образования 8-ОГ в ДНК антиоксидантый эффект увеличивался следующим образом: Guo > Ino > Xao > ГМФ.
Кроме исследования антиоксидантных свойств Xao in vitro проведены исследования его антиоксидантных свойств in vivo на мышах. Микроядерный тест является общепринятым методом для оценки эффективности различных защитных средств от генотоксических повреждений, таких как образование ПХЭ с МЯ в красном костном мозге. Было исследовано влияние Xao при его внутрибрюшинном введении мышам за 15 мин до воздействия рентгеновского излучения и через 15 мин после облучения в дозе 1,5 Гр на частоту образования МЯ в ПХЭ в костном мозге (табл. 2). При введении Xao необлученным животным не наблюдается изменения процента ПХЭ с МЯ. Как видно из табл. 2, процент ПХЭ с МЯ после воздействия рентгеновского излучения в дозе 1,5 Гр увеличился почти в 10 раз от 0,5 %, при отсутствии воздействия до 4,8 %. Введение Xao мышам до воздействия рентгеновского излучения привело к уменьшению частоты образования ПХЭ с МЯ примерно в 1,3 раза, при введении после - в 1,6 раза по сравнению с облученным контролем. При аналогичном введении Ino, Guo [1] и ГМФ [6] после облучения наблюдалось уменьшение в 1,5 и 1,7 раза соответственно.
Таблица 2
Влияние ксантозина (45 мкг/г), введенного внутрибрюшинно мышам за 15 мин до и через 15 мин после воздействия рентгеновского излучения в дозе 1,5 Гр, на частоту образования МЯ в ПХЭ в красном костном мозге мышей
|
Воздействие |
Количество |
Количество ПХЭ |
Количество ПХЭ с МЯ |
Процент ПХЭ с МЯ |
|
0 Гр |
5 |
10365 |
56 |
0,54± ± 0,07* |
|
0 Гр + Xao |
5 |
10236 |
51 |
0,50± ± 0,05* |
|
1,5 Гр |
5 |
10287 |
494 |
4,81 ± 0,42 |
|
1,5 Гр + Xao до облучения |
5 |
10312 |
371 |
3,60 ± 0,30* |
|
1,5 Гр + Xao после облучения |
5 |
10312 |
319 |
3,10 ± 0,30* |
Примечание: * - р < 0,05 относительно контроля (7 Гр) по критерию Стьюдента.
Защитный и антиоксидантный эффекты Xao in vivo и in vitro можно объяснить тем, что ксантозин имеет низкий окислительно-восстановительный потенциал (порядка 1,0 в Red/Ox) [9].
Другие возможные механизмы защитных свойств ксантозина in vivo могут быть связаны с влиянием его на процесс репарации ДНК и на нейтрализацию долгоживущих радикалов белка, которые способны генерировать АФК в течение длительного времени после воздействия ионизирующего излучения [2]. Известно, что производные ксантина являются неконкурентными лигандами аденозиновых рецепторов А1 и А2 [10], которые вовлечены в сигнальные пути, связанные с процессами дифференцировки, иммунного ответа и др.
Заключение
Таким образом, установлено, что ксантозин проявляет существенные антиоксидантные свойства in vitro и in vivo. Полученные данные позволяют предполагать, что ксантозин может эффективно препятствовать развитию окислительного стресса и может быть перспективным радиозащитным веществом.
Авторы благодарны д.ф.-м.н. А.Б. Гапееву за помощь в оформлении статьи. Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (10-04-00949-а; 10-04-00800-а) и Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых (МК-108.2010.4).
Рецензенты:
Гапеев А.Б., д.ф.-м.н., профессор, зав. лабораторией регуляции в биомедицинских системах Учреждения Российской Академии наук Института биофизики клетки РАН, г. Пущино;
Куликов А.В., д.б.н., ученый секретарь Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук, г. Пущино.
Работа поступила в редакцию 28.07.2011.