Альдегиддегидрогеназа (КФ 1.2.1.3., АлДГ) - фермент биотрансформации. Основная роль АлДГ сводится к утилизации высокотоксичных альдегидов. Ранее нами показано, что активность альдегиддегидрогеназы эритроцитов уменьшается при ожоге, что способствует развитию эндогенной интоксикации (Кирпичева, Зимин,2004). Известны различные механизмы регуляции активности ферментов: непосредственно на фермент или опосредованно через мембрану клеток. Поэтому представляет интерес изучить, в каком состоянии АлДГ находится в эритроцитах, в связанном с мембраной клеток или в «свободном».
Целью данной работы было выявить формы альдегиддегидрогеназы в эритроцитах человека.
Кровь для исследования брали из локтевой вены с 4%-ым раствором цитрата натрия (соотношение 9:1). Эритроциты осаждали центрифугированием при 800g в течение 10 мин. Плазму и лейкоциты удаляли. Эритроциты четырежды промывали 5-кратным объемом 0,15 М NaCl с 10мМ трис-НСl (рН 7,4).
Отмытые эритроциты гемолизировали. Для этого пробы эритроцитов по 0,3 мл помещали в пробирки с 10 мл 5 мМ трис-НСl (рН 7,4) и с 1 мМ ЭДТА. Через 30 мин гемолизат центрифугировали при 16000g в течение 10 мин (Макаренко, 1987). Активность АлДГ определяли в тенях эритроцитов и супернатанте по Б.М. Кершенгольц и Е.В. Серкиной (1981). Все процедуры производили при температуре 0-4оС.
Солюбилизацию эритроцитарной АлДГ проводили путем суспендирования теней эритроцитов в 0,15 М и 0,3 М растворах КСl. Спустя 20 минут суспензии центрифугировали 10 мин при 15000g. Об эффективности солюбилизации судили по разнице в активности АлДГ в исходных суспензиях теней, супернатантах и суспензиях теней и супернатантах после солюбилизации. Процедуру солюбилизации фермента с эритроцитарной мембраны повторяли троекратно.
Полученные результаты свидетельствуют, что часть АлДГ связана с мембраной, часть АлДГ находится в эритроцитах в «свободном» состоянии, не связанном с мембраной. Активность фермента в тенях эритроцитов составила 100,45+1,54 нмоль НАДН/мин* мг белка, активность в супернатанте - 88,48+2,64 нмоль НАДН/мин*мг белка.
Таким образом, 53,16% АлДГ находится в связанной с мембраной эритроцита форме, 46,84% - в «свободной».
Однократная солюбилизация 0,15 М КСl приводит к снижению активности альдегиддегидрогеназы в тенях и достоверному увеличению активности свободной АлДГ в супернатанте в 2,3 раза. Активность АлДГ в тенях составила 60,73+2,58 нмоль НАДН/мин*мг белка, в супернатанте - соответственно 189,53+7,84 нмоль НАДН/мин*мг белка.
Однократная солюбилизация 0,3 М раствором КСl вызывает достоверное увеличение активности АлДГ в супернатанте в 5,1 раз (активность 449,98+27,48 нмоль НАДН/мин*мг белка), после двухкратной солюбилизации - в 2,3 раза (активность 203,48+12,75 нмоль НАДН/мин*мг белка), после трехкратной солюбилизации - в 2,4 раза (активность 209,70+0,99 нмоль НАДН/мин*мг белка).
Эффект солюбилизации наиболее выражен после однократной солюбилизации при использовании в качестве солюбилизирующего агента 0,3 М раствор КСl. Таким образом, 0,3 М КСl является более сильным солюбилизирующим веществом.
Тот факт, что солюбилизация ни 0,15М КСl, ни 0,3 М КСl не приводит к достоверному снижению активности альдегиддегидрогеназы в тенях эритроцитов, позволяет предположить, что мембраносвязанная АлДГ прочно соединена с мембраной эритроцитов, возможно, ковалентными связями.