Ангиогенез имеет важное значение для роста и распространения рака почки [8, 9]. Однако при сложившемся мнении о неблагоприятном значении активного опухолевого ангиогенеза влияние развития микроциркуляторного русла в ПЗ на прогрессию рака почки изучено недостаточно.
Есть основания полагать, что биологическое и клиническое поведение опухоли в значительной степени зависит от интенсивности пролиферации и генетических нарушений, отражением которых может служить несбалансированность содержания ядерной ДНК (полиплоидия и анеуплоидия) опухолевых клеток. Наиболее прогностически неблагоприятными формами анеуплоидии являются многоклоновые опухоли.
Исследований, посвященных изучению биосинтетических и пролиферативных процессов в системе эпителий-соединительная ткань в тканях, прилежащих к раку почки, и влиянию на эти процессы плоидности опухоли, в доступной литературе, нами не обнаружено.
Цель исследования: изучить особенности гистологического строения перитуморозной зоны, а также биосинтетических и пролиферативных процессов, происходящих в сосудах и системе эпителий-соединительная ткань в тканях, прилежащих к раку почки, в зависимости от плоидности опухоли.
Материал и методы исследования
Изучен операционный материал 32 больных раком почки. Средний возраст больных составил 53,4 ± 1,2 года. Мужчин было 18 (56,2 %), женщин 14 (43,8 %). По гистологическому строению опухоли были представлены светлоклеточным раком. При группировке опухолей по клиническим стадиям (I-IV) было выделено: I стадии (T1N0M0) соответствовали 14 (43,8 %) наблюдений; II стадии (T2N0M0) 1 (3,1 %) наблюдение; III стадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) - 7 (21,9 %) и IV стадии (T4N0M0, T4N1M0, T^k^N2M1, - 10 (31,2 %).
Материал для исследования забирали из центра опухоли, перитуморозной зоны и неизмененной ткани почки, из максимально отдаленных от опухоли участков. За ПЗ принимали непосредственно прилежащую к псевдокапсуле ткань опухоли, псевдокапсулу и ткань, расположенную за псевдокапсулой до неизмененной ткани почки.
Степень злокачественности клеток опухоли оценивали по Fuhrman S.A. et al., (1982) [5]. В изученном материале было 12 (37,5 %) опухолей степени анаплазии G1, 11 (34,4 %) опухолей степени анаплазии G2 и 9 (28,1 %) степени G3.
При анализе биосинтетических и пролифератив- ных процессов элементов перитуморозной зоны использовался комплексный подход с применением различных методов окраски: гистологических - окраска гематоксилином и эозином; гистохимических - окраска на коллаген по ван Гизон; на эластические волокна - резорцин - фуксином по Вейгерту; серебрение аргирофильных волокон по Гомори; на нейтральные гликозаминогликаны (ГАГ) ШИК - реакция по Мак-Манусу; на кислые ГАГ - окраска альциановым синим по Стидмену и коллоидным железом по Хейлу; на ДНК по Фельгену; на общие нуклеиновые кислоты по Эйнарсону и на активность аргирофильных белков, ассоциированных с областью ядрышковых организаторов (AgNOR) по Howel W.M., Black D.A. [10], в нашей модификации [2]. В каждом случае на масляной иммерсии при увеличении *1000 рассчитывали плотность микроциркуляторного русла (ПМЦР) в 20 произвольно выбранных полях зрения.
Морфометрические и микроспектрофотометрические исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа изображений, состоящей из микроскопа Leica DМЕ, цифровой камеры Leica БС3 («Leica Microsystems AG», Германия), персонального компьютера Pentium 4 и программного обеспечения ВидеоТест - Морфология 5,2. Плоидометрию ДНК проводили на гистологических срезах, окрашенных по Фельгену. Среднее содержание ДНК в ядрах малых лимфоцитов принимали за диплоидное (2 с) и использовали в качестве стандарта. Для получения стандарта в каждом срезе оценивали 25-30 лимфоцитов. Затем в исследуемых эпителиальных клетках высчитывали индекс накопления ДНК (ИНДНК) в единицах плоидности (с) и строили гистограммы клонального распределения клеток, по количеству генетического материала выраженного в процентах. Выделяли две группы опухолей:
- диплоидные ( < 4c);
- полиплоидные, анеуплоидные ( > 4 c).
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0. Рассчитывали среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего значения (m), достоверность различия средних, которую рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента, данные считали достоверными при p < 0,05. Корреляционные взаимосвязи определяли путем расчета коэффициента корреляции Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
В процессе исследования материал был нами распределен на 2 группы: диплоидные и полиплоидные опухоли. Диплоидных опухолей оказалось 12 (37,5 %), полиплоидных - 20 (62,5 %). ИНДНК клеток опухолей имел сильную положительную взаимосвязь со степенью анаплазии опухоли (G) (r = 0,82).
Для изучения процентного содержания клонов клеток для каждой группы были построены гистограммы клонального распределения по количеству генетического материала.
Гистограмма распределения ядер по количеству ДНК в группе диплоидных опухолей (группа I) имела унимодальный характер с пиком в области 2-3 с. (рис. 1).
|
Рис. 1. Гистограмма распределения ядер по содержанию ДНК в диплоидных опухолях. По оси абсцисс - количество ДНК (в единицах плоидности); по оси ординат - количество клеток (в процентах) |
Гистограмма распределения ядер по ко - личеству ДНК в группе полиплоидных опухолей (группа II) имела вид широкого плато, со сдвигом вправо и разбросом значений от 2 до 13 с, что отражало значительную многоклоновость, поли- и анеуплоидию (рис. 2).
Рис. 2. Гистограмма распределения ядер по содержанию ДНК в полиплоидных опухолях. По оси абсцисс - количество ДНК (в единицах плоидности); по оси ординат - количество клеток
ПЗ рака почки имела различное гистологическое строение. Ширина ее колебалась от 152,5 до 2399,1 мкм и в среднем составила - 879,2 ± 92,8. Размеры и гистологическое строение ПЗ опухолей зависели, прежде всего, от плоидности опухоли (табл. 1).
Так, у полиплоидных новообразований (группа II) ширина ПЗ в среднем составила 1053,6 ± 119,4 мкм. При окраске по ван Гизон в таких ПЗ отмечалась выраженная фуксинофилия коллагеновых волокон, волокна давали интенсивную ШИК-реакцию при окраске по Мак-Манусу на нейтральные ГАГ. При окраске на эластические волокна резорцином фуксином по Вейгерту отмечено большое число тонких извитых волокон интенсивной сиреневой окраски, также отмечались толстые эластические мембраны на границе между опухолевой тканью и ПЗ. Аргирофильные волокна были утолщены, на границе ПЗ с опухолью они образовывали сплетения и мембраны. Кислые ГАГ отмечали в значительном количестве в зонах обнаружения эластических волокон. Плотность лимфо-плазмоцитарной инфильтрации в ПЗ была умеренной или высокой, часто были видны фолликулоподобные структуры.
У диплоидных опухолей (группа I) ширина ПЗ в среднем составила 580,5 ± 71,4 мкм. Коллагеновые волокна при окраске по ван Гизону в таких ПЗ окрашивались в розоватый цвет с участками желтого, в то же время волокна коллагена были ШИК-позитивны при реакции по Мак-Манусу на нейтральные ГАГ. Кислые ГАГ в соединительной ткани не обнаруживались, но определялись в стенках сосудов. При окраске на эластические волокна резорцином - фуксином по Вейгерту отмечено высокое содержание тонких извитых волокон, тонкие эластические мембраны на границе с опухолью обнаруживались лишь на некоторых участках. В пучках коллагеновых волокон определялись истонченные «штопорообразные» аргирофильные волокна. Плотность лимфо-плазмоцитарной инфильтрации была слабой или умеренной.
Таблица 1
Морфометрические параметры элементов ПЗ в зависимости от плоидности опухоли
|
Параметры ПЗ |
Плоидность опухолей |
|
|
диплоидные |
полиплоидные |
|
|
Ширина пе- ритуморозной зоны, мкм |
580,6 ± 71,4* |
1053,6 ± 119,4* |
|
Площадь ядер эпителия канальцев, мкм2 |
38,9 ± 2,1* |
56,2 ± 5,5* |
|
Площадь ядер миофиброблас- тов, мкм2 |
32,4 ± 2,2* |
64,7 ± 4,2* |
|
Плотность сосудов микроциркуляции |
5,8 ± 0,6* |
8,6 ± 0,8* |
Примечание: * - p < 0,05.
В ПЗ, в большем или меньшем количестве, нами отмечались элементы канальцевого аппарата почки. В ПЗ полиплоидных опухолей канальцев было значительно больше, они выглядели замурованными в плотной соединительной ткани и содержали небольшое число клеточных элементов. Такие канальцы были окружены резко ШИК-положительной базальной мембраной. При окраске нитратом серебра по Гомори базальная мембрана выглядела утолщенной. Клетки канальцевого эпителия имели признаки атипизма: полиморфизм и гиперхромию ядра, увеличение ядерно-ци- топлазматического соотношения, большое количество общих НК. Площадь клеточного ядра в среднем составила 56,2 ± 5,5 мкм2. Число AgNORs в ядрах клеток достигало 5,2 ± 0,3 на 1 ядро. В ядрах канальцевого эпителия ПЗ диплоидных опухолей число AgNORs составило в среднем 2,2 ± 0,2 на 1 ядро (табл. 2). Ядра клеток были округлой формы, небольшого размера, гиперхром- ность отсутствовала. Площадь клеточного ядра составила 38,9 ± 2,2 мкм2. Клетки располагались на тонкой ШИК-положительной базальной мембране.
Таблица 2
Параметры ядрышкового аппарата клеток ПЗ в зависимости от плоидности опухоли
|
Параметры ядрышко вого аппарата клеток ПЗ |
Плоидность опухолей |
|
|
диплоидные |
полиплоидные |
|
|
число ядрышек, на ядро: |
||
|
в ядрах эпителия канальцев |
1,3 ± 0,2* |
1,6 ± 0,1* |
|
в ядрах миофибро- бластов |
1,2 ± 0,1* |
1,5 ± 0,1* |
|
в ядрах эндотелия |
1,3 ± 0,08* |
1,5 ± 0,1* |
|
Число AgNORs, на ядро: |
|
|
|
в ядрах эпителия канальцев |
2,2 ± 0,2* |
5,2 ± 0,3* |
|
в ядрах миофибро- бластов |
1,5 ± 0,2* |
2,8 ± 0,4* |
|
в ядрах эндотелия |
1,7 ± 0,1* |
3,5 ± 0,4* |
Примечание: * - p < 0,05.
При микроспектрофотометрическом исследовании ДНК клеток эпителия канальцев в ПЗ обнаружено увеличение среднего содержания ДНК в полиплоидных опухолях (рис. 3).
Увеличение ИНДНК сопровождалось нарастанием гетерогенности клеток нефротелия по содержанию ДНК и появлением поли- и анеуплоидии. Также была отмечена тенденция к уменьшению коэффициента эллиптичности - от 0,75 при диплоидных опухолях до 0,69 при полиплоидных опухолях.
Клетки миофибробластического ряда ПЗ полиплоидных опухолей имели увеличенные ядра. Площадь ядра в среднем составила 64,7 ± 4,2 мкм2. Они содержали 1-2 ядрышка, в среднем 1,5 ± 0,1 на 1 ядро, при этом отмечалось многообразие морфо- функциональных типов ядрышек. Отмечали ядрышки кольцевидного, нуклеолонемного типов и переходные между ними формы. Число AgNORs в таких клетках составило 2,8 ± 0,4 на 1 ядро. Данные клетки можно отнести к активно синтезирующим юным миофибробластам. В ПЗ диплоидных опухолей ядра клеток миофибробластического ряда имели удлиненную волнообразную форму. Площадь ядра в среднем составила - 32,4 ± 2,2 мкм2. Ядра содержали преимущественно одно кольцевидное ядрышко, среднее число ядрышек на 1 ядро составило 1,2 ± 0,1 на 1 ядро. Число AgNORs составило 1,5 ± 0,2 на 1 ядро. Такие клетки нами были отнесены к зрелым малоактивным миофиброцитам.
Рис 3. Гистограмма распределения ДНК в ядрах эпителия канальцев в норме и перитуморозной зоне диплоидных и полиплоидных опухолей. По оси абсцисс - количество ДНК (в единицах плоидности); по оси ординат - количество клеток (в процентах)
При исследовании ПМЦР в ПЗ установлено вовлечение сосудов в патологический неоангиогенез. В большинстве случаев сосуды расположенные рядом с опухолью, не имели мышечной оболочки. Встречались структуры, имеющие трубчатое строение и образованные одним слоем эндотелиоподобных клеток. В ПЗ полиплоидных опухолей ПМЦР составила - 8,64 ± 0,8, а в диплоидных опухолей - 5,8 ± 0,6. Также отмечали возрастание числа AgNORs до 3,5 ± 0,4 в эндотелии новообразованных сосудов ПЗ полиплоидных опухолей, по сравнению с диплоидными опухолями (1,7 ± 0,1). ПМЦР в ПЗ коррелировала с наличием региональных и отдаленных метастазов (r = 0,72). Соединительная ткань вокруг новообразованных сосудов была представлена пучками рыхлых тонких бледно окрашенных волокон. В соединительной ткани, окружающей сосуды, определялось значительное количество тучных клеток, причем в ПЗ полиплоидных и анеуплоидных опухолей преобладали дегранулированные формы тучных клеток. В предсуществующих сосудах ПЗ опухолей обоих степеней плоидности отмечали явления выраженного эластофиброза, с сужением просвета и гиперплазией эластических мембран.
Таким образом, ПЗ рака почки не является статически замершей, неактивной системой или «капсулой» опухоли в привычном понимании, а является той «ареной», на которой происходят значимые динамические преобразования биосинтетических и пролиферативных процессов в клеточных и волокнистых элементах соединительной ткани, которые, в частности, во многом зависят от плоидометрических характеристик опухоли.
Выводы
- Обнаружена взаимосвязь между показателем ИНДНК и степенью злокачественности опухолевых клеток по Фурману (r = 0,82).
- Биосинтетические, пролиферативные процессы в клеточных элементах и активность неоангиогенеза в ПЗ взаимосвязаны с плоидностью опухоли.
- В ПЗ поли- и анеуплоидных опухолей обнаружены выраженные явления склероза и эластоза, что имеет защитный, адаптивный характер, но в то же время ведет к развитию гипоксии и диспластическим изменениям регенерирующего эпителия канальцев.
- В ПЗ поли- и анеуплоидных опухолях по сравнению с диплоидными отмечена более высокая ПМЦР и число AgNORs в эндотелии, указывающее на увеличение потенциальной скорости роста сосудов, что способствует инвазии опухолевых клеток и метастазированию.
Рецензенты:
- Высоцкий Ю.А., д.м.н., зав. кафедрой нормальной анатомии человека ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет», г. Барнаул;
- Калачев Г.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой анатомии, физиологии и валеологии ГОУ ВПО «Алтайская государственная педагогическая академия», г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 24.06.2011.