Цель исследования: изучить влияние радонотерапии на уровень антинуклеарных антител и хромосомные аберрации в клетках синовии больных посттравматическим остеоартрозом.
Материал и методы исследования
Под наблюдением находились 28 больных в возрасте 31-58 лет с посттравматическим остеоартрозом (ПТОА) коленных суставов (КС) I-II стадии по классификации Келлгрена-Лоуренса (1957). Больных для исследования отбирали методом сплошной выборки при добровольном письменном согласии в соответствии с решением Департамента государственной аттестации научных и научно-практических работников Минобразования России «О порядке проведения биомедицинских исследований у человека» (2002 г.) и «Правилами клинической практики» (Приказ МЗ РФ № 266 от 19.06.03). Исследование одобрено Этическим комитетом Алтайского государственного медицинского университета (протокол № 26 от 30.04.2008).
Пациентам назначали общие радоновые ванны с концентрацией радона 0,19 кБк/л, температурой 36 °С, экспозицией 15 минут, на курс 14 процедур, эквивалентная доза (ЭД) альфа-излучения за курс составила 280 мкЗв.
Синовиальную жидкость получали пункцией коленного сустава в объеме 0,1-0,2 мл до лечения при поступлении больного в санаторий и через 3 недели (по окончании лечения). Культивирование синовио- цитов проводили по методу P.S. Moorhead (1989) с некоторыми модификациями. Культуры инкубировали в термостате при 37о в течение 48-55 часов. За 3 часа до приготовления препаратов во флаконы с культурами синовиоцитов вводили колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг на 1 мл среды. Гипотоническую обработку производили 6 минут 0,56 % раствором КИ. Фиксировали клетки в трех сменах смеси ледяной уксусной кислоты с метанолом (1:3). В последней смене фиксатора оставляли 0,5 мл надосадочной жидкости, в которой тщательно ресуспендировали клетки и капали по 1-2 капли на охлажденные предметные стекла, высушивали. Через 1-2 недели хранения препаратов проводили дифференциальное окрашивание хромосом, используя технику G-окраски. Препараты помещали в 0,025 % раствор трипсина, подогретый до 37о на 1-2 минуты, ополаскивали в 2xSSC (стандартном солевом растворе), в трех сменах этилового спирта (70o, 96°, 100°), окрашивали по Романовскому-Гимза разведенным 1:50 фосфатным буфером Зеренсена рН 6,8 в течение 5-15 минут. Изучение хромосом проводили при увеличении 10х90,используя микроскоп Reichert NP-1640 (Австрия). Для анализа отбирали метафразы с учетом предложений Н.П. Бочкова (1974).
Для идентификации хромосом человека использовалась система классификации хромосом, принятая в 1971 году на Парижской конференции по цитогенетике человека [1]. У каждого человека изучено не менее 100 метафаз, а при использовании микроядерного теста - 3000 клеток. У каждого больного при использовании компьютерного метода анализировали 250-300 интерфазных клеток. Кроме того, визуально на препаратах просматривали у каждого больного в каждом случае (до и после лечения) не менее 10000 клеток, отмечая особенности морфологии ядра, наличие апоптотически измененных клеток, митозов, патологически измененных делящихся клеток согласно критериям, представленным нами ранее [2].
Из структурных нарушений хромосом учитывались хроматидные и хромосомные разрывы, ацентрические одиночные и парные фрагменты и обмены. Критерием отличия разрыва от пробела считалось обязательное его смещение, а не расстояние неокрашенного участка, поскольку длина пробела может варьироваться. Кроме того, учитывались аномалии в числе хромосом: анеуплоидные (гипо- и гиперплоидные) и полиплоидные клетки, а также частота ассоциаций ядрышкообразующих хромосом.
Активность эксцизионной ДНК-репарации оценивалась по методу Г.Д.Засухиной (1975). Репаративный синтез (PC ДНК), индуцированный 4-нитрохинолин-1-оксидом (4 НХО), определяли с помощью метода сцинтилляционной радиометрии по включению Н3 - тимидина в общую массу клеток при подавлении репликативного синтеза ДНК гидроксимочевиной (10 мкмоль/мл). Для индукции репаративного синтеза использовали 4 НХО в концентрации 2,510-6 М при экспозиции 30 мин. Концентрация Н3 тимидина - 10 мкК/мл. Изотоп добавляли сразу после обработки мутагенами и инкубировали 2 часа в среде роста. Клетки промывали и определенное их количество осаждали на миллипоровые фильтры (диаметр пор 0,3 ц) в 5 %-й трихлоруксусной кислоте. Радиоактивность просчитывали в толуольном сцинтилляторе на счетчике Mark III. Об интенсивности репаративного синтеза судили по величине индекса стимуляции, представляющего собой отношение имп/мин в обработанных мутагеном клетках к имп/мин в контрольных клетках.
Антитела к нДНК (ANA) обнаруживали с помощью реакции связывания комплемента по методу и при использовании тестовых систем разработанных. Lahey Hitchcock Medical Center (Massachusetts USA). В зависимости от уровня антител всех обследованных больных разделяли на 3 группы: 1-я группа - больные имели титр антител 1:80 и менее; 2-я группа - 1:160-1:320 и 3-я более 1:320.
Для проверки достоверности различий между исследуемыми группами, в которых данные были распределены по нормальному закону, использовали t-критерий Стьюдента. В случае отличия вида распределения изучаемых переменных от нормального гауссового распределения, достоверность различий проверяли при помощи непараметрических критериев: U-критерия Манна-Уитни, %2 и методом ранговой корреляции по Спирмену с применением пакета компьютерных программ Statistica-5. Различия считали достовреными при уровне значимости р < 0,05. Критерий %2 употребляли для сравнения эмпирического распределения частоты хроматидных и хромосомных разрывов и анеуплоидии по группам хромосом и по отдельным хромосомам набора с ожидаемым теоретическим распределением цитогенетических нарушений по группам хромосом и отдельным хромосомам. При этом предполагалась равная вероятность моносомий или трисомий для любой хромосомы генома, а также равная вероятность индукции повреждения для любого участка у любой хромосомы набора, то есть пропорционально ее длине.
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что у больных остеоартроза- ми по сравнению со здоровыми донорами существенно возрастает частота клеток синовии с цитогенетическими нарушениями (табл. 1).
Таблица 1
Частота синовиоцитов с цитогенетическими нарушениями в синовии у больных ПТОА КС в зависимости от уровня антинуклеарных антител (в %)
|
Регистрируемый показатель |
1-я группа больных |
2-я группа больных |
3-я группа больных |
|
Титр ANA 1:80 и ниже |
Титр ANA 1:160- 1:320 |
Титр ANA выше 1:320 |
|
|
Число клеток со структурными нарушениями хромосом |
3,5 ± 0,4 |
21,6 ± 1,5* |
29,6 ± 0,9* |
|
Число хромосом с нарушениями |
3,9 ± 0,4 |
27,5 ± 2,1* |
34,1 ± 2,2* |
|
хромосомные разрывы |
0,3 ± 0,2 |
2,6 ± 0,8* |
3,9 ± 0,7* |
|
хроматидные разрывы |
2,5 ± 0,3 |
19,1 ± 1,6* |
22,3 ± 1,7* |
|
обмены |
0,3 ± 0,2 |
1,4 ± 0,6** |
2,4 ± 0,4* |
|
прочие |
0,8 ± 0,2 |
4,3 ± 1,0* |
5,8 ± 1,2* |
|
Число клеток с измененным числом хромосом |
4,6 ± 0,7 |
14,3 ± 0,9* |
17,1 ± 1,5* |
|
гипоплоидных |
4,2 ± 0,6 |
9,1 ± 1,0* |
11,1 ± 1,1* |
|
гиперплоидных |
0,3 ± 0,2 |
1,4 ± 0,6** |
3,0 ± 0,7* |
|
полиплоидных |
0,1 ± 0,08 |
3,4 ± 0,5** |
3,0 ± 0,8* |
|
Всего клеток с цитогенетическими нарушениями |
6,6 ± 0,7 |
34,1 ± 2,8* |
42,3 ± 1,9* |
Примечание:
* - значения, достоверно отличающиеся от данных 1-й группы больных ср < 0,01; ** - значения, достоверно отличающиеся от данных 1-й группы больных с р < 0,05.
У больных 3-й группы отмечена наибольшая частота клеток с цитогенетически- ми нарушениями - 42,3 ± 1,9 % (в контроле 6,6 ± 0,7 %), при этом среди аномальных клеток наблюдались как с нарушениями в структуре хромосом (29,6 ± 1,5 % при 3,5 ± 0,4 % в контроле; р < 0,01), так и с нарушениями в числе хромосом (17,1 ± 1,5 % при 4,6 ± 0,7 % в контроле; р < 0,01). При этом у больных 2-й группы частота клеток с цитогенетическими нарушениями составляет соответственно 34,1 ± 0,8 и 14,3 ± 0,9 %, что, однако, значительно превышает уровень, наблюдаемый в синовии у больных 1-й группы (р < 0,01). Корреляционный анализ полученных результатов свидетельствовал о том, что у больных наблюдается достоверная (р < 0,01) прямо пропорциональная зависимость (r = 0,82) между частотой клеток с цитогенетическими нарушениями и уровнем показателей антинуклеарных антител (рисунок).
Полученные данные свидетельствовали (табл. 2), что после лечения у больных 3-й группы происходит достоверное снижение основных показателей цитогенетического анализа синовиоцитов, в то же время эти данные были существенно выше наблюдаемого уровня у больных с титром антинуклеарных антител, равным меньше 1:80 (см. табл. 1). Кроме того, после курса лечения с использованием РТ в ЭД альфа-излучения 280 мкЗв у больных отмечено существенное снижение титра антинуклеарных антител в синовии. Так, если до лечения титр у больного составлял 1:320 и выше, то после курса лечения титр снизился до величины 1:160 или 1:80 и ниже.
Анализ ассоциаций ядрышкообразую- щих хромосом показал, что у больных с титром антинуклеарных антител 1:320 и выше по сравнению с 1-й группой больных (титр антинуклеарных антител 1:80 и ниже) наблюдается повышенный уровень числа ассоциирующих хромосом в расчете на одну клетку, при этом увеличивается число клеток с ассоциациями 5 и 4-х хромосом (табл. 3).
Выполненный корреляционный анализ свидетельствовал, что имеется достоверная обратно пропорциональная связь между числом клеток с большим числом ассоци-
|
Титр антинуклеарных антител Прямо пропорциональная связь между уровнем антинуклеарных антител и частотой клеток с цитогенетическими нарушениями в синовии больных ПТОА КС |
Табл.2. Частота клеток с цитогенетическими нарушениями в культурах синовиоцитов у больных ПТОА КС и изменение титра антинуклеарных антител в синовии до и после РТ с ЭД альфа-излучения 280 мкЗв
|
Регистрируемый показатель |
До РТ (титр ANA выше 1:320) |
После РТ (титр ANA ниже 1:160) |
|
Число клеток со структурными нарушениями хромосом |
29,6 ± 1,5 |
15,8 ± 2,2* |
|
Число хромосом с нарушениями |
34,1 ± 2,2 |
17,2 ± 2,4* |
|
хромосомные разрывы |
3,9 ± 0,7 |
1,2 ± 0,3*+* |
|
хроматидные разрывы |
22,3 ± 1,7 |
12,7 ± 2,1* |
|
обмены |
2,4 ± 0,4 |
1,9 ± 0,5 |
|
прочие |
5,6 ± 1,0 |
1,4 ± 0,5* |
|
Число клеток с измененным числом хромосом |
17,1 ± 1,5 |
5,8 ± 0,8* |
|
гипоплоидных |
11,1 ± 1,1 |
2,7 ± 0,5* |
|
гиперплоидных |
3,0 ± 0,7 |
1,4 ± 0,5 |
|
полиплоидных |
3,0 ± 0,8 |
1,7 ± 0,2** |
|
Всего клеток с цитогенетическими нарушениями |
42,3 ± 1,9 |
21,6 ± 2,6* |
ирующихся акроцентрических хромосом и митотической активностью синовиоцитов (r = -0,68; P < 0,01). Кроме того, установлена зависимость между величиной ядрышка и числом хромосом, вступающих в ассоциации (r = +0,72; P < 0,01), а также митотиче- ской активностью культуры синовиоцитов (r = +0,56; P < 0,01).
Уровень цитогенетических аберраций в клетках больных был определен также микроядерным тестом. Анализ проводили в блокированных цитохолазином В синовиоцитах. ДНК-репаративный синтез, индуцированный 4-нитрохинолин-1-оксидом (4-НХО), определяли с помощью метода сцинтилляционной радиометрии по включению 3Н-тимидина в общую массу клеток при подавлении репликативного синтеза ДНК гидроксимочевиной (10 мкмоль/мл). Результаты микроядерного и ДНК-репаративного анализа свидетельствовали о том, что больные ПТОА КС 3-й группы независимо от его клинической формы представляют статистически однородную группу. Так, установлено, что у этих больных при поступлении и при выписке содержание синовиоцитов с микроядрами было достоверно выше, чем у больных 1-й группы (табл. 4).
Таблица 3
Число клеток с ассоциациями ядрышкообразующих хромосом в синовиоцитах больных ПТОА КС до и после РТ с ЭД альфа-излучения 280 мкЗв
Примечание: * - значения достоверно отличающиеся от уровня наблюдаемого до лечения с р < 0,01; ** - значения достоверно отличающиеся от уровня наблюдаемого до лечения с р < 0,05.
Таблица 4
Уровень синовиоцитов с микроядрами и ДНК-репаративная активность в клетках синовия у больных ПТОА КС до и после РТ в ЭД альфа-излучения 280 мкЗв
|
Показатель |
До РТ в ЭД альфа-излучения 280 мкЗв |
После РТ в ЭД альфа- излучения 280 мкЗв |
|
Число синовиоци- тов с микроядрами (в %) |
3,0 ± 0,2* |
1,1 ± 0,1* |
|
Индекс стимуляции ДНК-репаративной активности (в усл. ед.) |
1,2 ± 0,2* |
2,5 ± 0,4* |
Примечание: * - достоверность различий p < 0,05 показателей 3-й группы от показателей 1-й группы.
Анализ состояния эксцизионной ДНК-репарации синовиоцитов показал, что после РТ с ЭД альфа-излучения 280 мкЗВ у больных отмечается возрастание этого показатели до уровня, характерного для здоровых доноров, при этом в синовии наблюдается снижение числа клеток с микроядрами (см. табл. 4). Кор - реляционный анализ позволяет заключить о наличии обратно пропорциональной достоверной связи между анализируемыми значениями ДНК-репарации и числом клеток с микроядрами.
Выводы
1. В синовии больных с посттравматическим остеоартрозом возрастает - в зависимости от титра антинуклеарных антител - на 80,6-84,4 % количество синовио- цитов с цитогенетическими нарушениями в виде различных хромосомных аберраций с прямо пропорциональной связью между этими явлениями, что свидетельствует о непосредственном влиянии антинуклеарных антител на изменения в ядерном аппарате синовиоцитов.
2. Под влиянием радонотерапии в эквивалентной дозе альфа-излучения 280 мкЗв в синовии больных посттравматическим остеоартрозом происходят:
- снижение на 50-75 % титра антинуклеарных антител к клеткам синовии;
- уменьшение на 48,9 % количества хромосомных аберраций синовиоцитов и числа аномалий в их ядерном аппарате;
- повышение митотической активности синовиоцитов;
- увеличение на 52 % активности белкового синтеза в синовиоцитах;
- снижение на 63,4 % числа клеток с микроядрами;
- усиление пролиферативных процессов в синовиальной среде пораженного сустава.
Рецензенты:
- Корниясова Е.В., д.м.н., профессор кафедры травматологии, ортопедии и ВПХ ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава РФ», г. Барнаул;
- Кулишова Т.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой восстановительной медицины ФПК и ППС ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава РФ», г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 30.05.2011.