Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

ACER PLATANOIDES L. PHYSIOLOGICAL EFFECTS ON THE STRESS CAUSED BY ENVIRONMENT POLLUTION WITH HEAVY METALS

Гарифзянов А.Р., Иванищев В.В.
The complex estimation of Acer platanoides L. physiological effects as a part of the metallurgical enterprises sanitary-protective plantings was carried out. It was shown that the accumulation of Mn, Zn and Cd in A. platanoides leaves was not accompanied by oxidizing stress increase in cells that proved to be true the H2O2 quantity, intensity of lipids oxidations and a parity of photosynthetic pigment groups. In leaves the accumulation of glutathione and phenolic compounds, and the peroxidases and catalases activity increase were observed. Keywords: Acer platanoides, heavy metals, stress, active oxygen forms, antioxidizing system

Высокая токсичность тяжелых металлов (ТМ) обусловливает внимание исследователей к загрязнению ими компонентов окружающей среды. Известно, что значительную роль в процессах миграции ТМ играют растения. Аккумуляция ТМ может приводить к развитию в их клетках окислительного стресса, сопряженного с избыточной генерацией активных форм кислорода (АФК). К числу последних относят производные кислорода радикальной природы (супероксид-радикал (анион-радикал) О2•-, гидроперекисный радикал НО2, гидроксил-радикал НО), а также его реактивные производные (перекись водорода Н2О2, синглетный кислород 1О2 и пероксинитрит) [10].

В последнее время большое количество исследований посвящено изучению влияния ТМ на продукцию АФК. Доказано, что активная генерация АФК наблюдается при действии ионов железа, меди, цинка, никеля, алюминия, кадмия, свинца и др. [9]. В результате повышенной генерации АФК в клетках может произойти окисление липидов, углеводов, белков, повреждение ДНК и РНК, дезорганизация цитоскелета [5].

Важнейшим механизмом устойчивости растений в условиях загрязнения среды ТМ является активизация системы антиоксидантной защиты (АОС). Наибольшее значение придается роли, выполняемой низкомолекулярными метаболитами (аскорбиновая кислота, глутатион, пролин, каротиноиды, флавоноиды и др.) и антиоксидантными ферментами (СОД, каталаза, пероксидазы) [10]. Исследований, в которых были бы одновременно представлены отмеченные реакции антиоксидантной системы в пределах одного биологического объекта, мало. Древесные растения представляют в этом аспекте особый интерес, поскольку обладают высоким биологическим потенциалом при способности длительно депонировать токсичные соединения в многолетних органах.

В связи с этим было проведено исследование, целью которого являлось изучение физиологических реакций Acer platanoides L. на стресс, инициируемый загрязнением среды тяжелыми металлами.

Материал и методы исследования

Для исследования были выбраны 3 постоянные модельные площадки, 2 из которых располагаются в пределах санитарно-защитных насаждений (СЗН) крупнейших металлургических предприятий г. Тулы: I точка пробоотбора - ОАО «Косогорский металлургический завод»; II точка пробоотбора - комплекс предприятий ОАО СП АК «Тулачермет», ОАО «Ванадий-Тулачермет», ОАО «Палема». Ранее проведенное исследование позволило установить в почвах санитарно-защитных насаждений превышение ПДК (или ОДК) по Mn (в 4,7 раза), Pb (в 1,5 раза) и Zn (в 2 раза) и фонового уровня по Fe, Mn, Ti, Sc, V, Cr, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Rb, Sr, Zr, Ba и Pb [2]. За условно контрольную (чистую или фоновую) зону была принята территория Центрального парка культуры и отдыха (ЦПКиО) им. П.П. Белоусова (контроль).

Листья Acer platanoides L. отбирали с ветвей 1-2 года жизни на расстоянии 2-3 м от поверхности грунта по периметру кроны деревьев типичного габитуса одного возраста. Содержание перекиси водорода оценивали по количеству образующегося окрашенного комплекса пероксида титана [7]. Степень перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по методу, основанному на определении количества соединений, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реагирующих соединений), в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) [6]. Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов a, b и каротиноидов) определяли спектрофотометрически в этанольных экстрактах [8]. Определение содержания аскорбиновой кислоты и восстановленного глутатиона проводили титриметрическим методом с 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (аскорбиновая кислота) и йодата калия (восстановленный глутатион) [3]. Содержание фенольных соединений оценивали спектрофотометрически в этанольных экстрактах: с реактивом Фолина-Дениса (сумма водорастворимых фенольных соединений) и 2 %-м спиртовым раствором хлорида алюминия (флавоноиды) [4]. Определение активности ферментов проводили в фосфатно-буферных экстрактах, как описывали ранее [1]:каталазы - манометрическим методом с использованием модифицированного аппарата Варбурга, гваяколовой пероксидазы - спектрофотометрическим методом с пирогаллолом.

Каждый опыт проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных компьютерных программ MS Excel 2003 и SigmaStat 3.1. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения определяемых величин и их стандартные ошибки (Р > 0,95). К полученным данным применен стандартный однофакторный дисперсионный анализ с использованием для оценки достоверности при множественном сравнении фактического значения q-критерия Ньюмена-Кейлся (критическое значение критерия при уровне значимости 0,05 в нашем исследовании равнялось 3,461).

Результаты исследований и их обсуждение

Произрастание A. platanoides на загрязненной тяжелыми металлами территории СЗН обусловливает процессы сорбции, перераспределения и аккумуляции ТМ в различных тканях и органах. Ранее проведенное исследование показало, что в листьях A. platanoides в значительном количестве аккумулируются Mn (180-260 мг/кг сухого вещества), Zn (20-40 мг/кг) и Cd (0,11-0,16 мг/кг) [2]. При этом аккумуляция ТМ из окружающей среды сопряжена с развитием окислительного стресса, обязательным условием которого является генерация избыточных количеств АФК. Поскольку перекись водорода является относительно стабильной АФК (время жизни около 1 мс), способной диффундировать от места образования [10], то изучение ее генерации в стрессовых условиях особенно актуально.

Проведенное исследование показало, что при произрастании A. platanoides в составе СЗН, содержание H2O2 в листьях было на уровне контрольного значения (0,104 ± 0,010 ммоль/г). При этом анализ результатов количественного определения МДА, являющегося продуктом перекисного окисления фосфолипидов мембран, подтвердил низкую интенсивность окислительных процессов. Количество МДА в листьях A. platanoides было в пределах 0,88 ± 0,14 нмоль/г свежей массы и не превосходило таковой показатель для растений в контроле.

Известно, что одним из наиболее чувствительных аппаратов растений к индуцированному ТМ окислительному стрессу является фотосинтетический. Важное условие его эффективной работы - поддержание стабильного количества и соотношения разных групп пигментов. Проведенное исследование показало, что в условиях промышленного загрязнения содержание пигментов в листьях A. platanoides было ниже, чем в контроле. В частности, количество хлорофилла а оказалось меньше в 3,4-3,8 раз, хлорофилла b - в 3,5 раза, каротиноидов - в 3,6 раз (рисунок).

pic

Содержание фотосинтетических пигментов в листьях A. platanoides при стрессе

По своим функциональным свойствам молекулы пигментов различаются, поэтому критичным для поддержания нормального уровня фотосинтеза и сопряженных энергетических процессов является соотношение разных фотосинтетических пигментов. Соотношение пигментов меняется в течение онтогенеза пластид, листа и всего организма, но оно относительно определенно и генетически детерминировано. Проведенное исследование показало, что отношение количества двух форм хлорофилла («Хл a/Хл b») в листьях A. platanoides, а также количества общего хлорофилла (a + b) к содержанию каротиноидов в контроле было в пределах 2,6 и 6,44 соответственно (см. рисунок). Такое соотношение фотосинтетических пигментов является типичным для здоровых, хорошо функционирующих зеленых растений. В условиях техногенного загрязнения соотношение пигментов не изменялось.

Поскольку в листьях A. platanoides соотношение фотосинтетических пигментов оставалось на уровне контрольного значения, то общее снижение их содержания, по-видимому, отражает не столько характер поврежденности аппарата фотосинтеза, сколько переход его на новый физиологический уровень функционирования, что позволяет ему относительно стабильно работать, но, возможно, с меньшей эффективностью.

Таким образом, можно заключить, что в листьях A. platanoides под действием ТМ не происходило развитие окислительного стресса. Это подтверждается анализом результатов по накоплению H2O2 и МДА, а также поддержанием стабильного соотношения разных групп фотосинтетических пигментов. Невыраженность окислительных процессов может свидетельствовать о функционировании в листьях A. platanoides мощной антиоксидантной системы.

Специфической группой антиоксидантов являются специализированные ферменты (СОД, пероксидазы, каталаза и др.). Проведенное исследование показало, что в листьях A. platanoides, произрастающего в условиях повышенного содержания ТМ в окружающей среде, активность гваяколовой пероксидазы была выше, чем в контроле, в 11-14 раз, достигая максимальной величины (0,336 ± 0,053 мкмоль/мин⋅г) во II точке пробоотбора (таблица). Анализ результатов определения активности каталазы не позволил установить однозначной реакции данного компонента АОС на загрязнение среды ТМ. В частности, активность фермента в листьях A. platanoides I точки пробоотбора (140 ± 5 мкмоль/мин⋅г) была выше контрольной величины на 14 %. Отсутствие достоверного повышения активности каталазы по II точке пробоотбора может быть следствием ее ингибирования перекисью. В этом случае пероксидазы становятся главными ферментами, катализирующими разложение H2O2. Это утверждение согласуется с результатами по определению активности гваяколовой пероксидазы, активность которой была максимальной во
II точке пробоотбора.

Компоненты антиоксидантной системы A. platanoides при стрессе

Точка
пробоотбора

Содержание

Активность,
мкмоль/мин⋅г

аскорбиновой кислоты, мг/г свежей массы

глутатиона, мг/г свежей массы

суммы фенольных соединений, мг/г сухой массы

флавоноидов, мг/г сухой массы

гваяколовой пероксидазы

каталазы

i

0,56 ± 0,05

0,54 ± 0,06

37,0 ± 1,1

3,0 ± 0,1

0,266 ± 0,048

140 ± 5

II

0,60 ± 0,06

0,59 ± 0,07

43,2 ± 1,5

39,8 ± 2,5

0,336 ± 0,053

107 ± 3

Контроль

0,65 ± 0,07

0,26 ± 0,06

32,6 ± 1,8

30,6 ± 3,2

0,024 ± 0,005

121 ± 11

Ферменты расположены в различных тканевых структурах и клеточных компонентах, имеют разную субстратную специфичность и сродство к АФК. При действии стрессоров наблюдается быстрая инактивация конститутивного пула антиоксидантных ферментов. Эти данные обусловили появление точки зрения о том, что низкомолекулярные органические антиоксиданты в ряде случаев способны более эффективно осуществлять защиту метаболизма от АФК [5]. Проведенное исследование показало, что произрастание A. platanoides в среде с повышенным содержанием ТМ в почве приводит к изменению количества накопленных в листьях низкомолекулярных соединений, проявляющих антиоксидантные свойства (см. таблицу). В частности показано, что в листьях A. platanoides содержание глутатиона в 2 раза, а суммы водорастворимых фенольных соединений на 12-26 % было выше, чем в контроле.

Для листьев A. platanoides II точки пробоотбора было отмечено также накопление флавоноидов, превышающее таковой уровень в контроле в 1,3 раза, но 10-кратное понижение его в I точке. Подобная особенность может определяться расходованием флавоноидов, как компонентов АОС, для поддержания на низком уровне концентрации АФК. Достоверных изменений в содержании аскорбиновой кислоты в листьях A. platanoides СЗН не происходило (см. таблицу).

Выводы

Таким образом, можно заключить, что, аккумуляция Mn, Zn и Cd в листьях A. platanoides не сопровождалась развитием в клетках окислительного стресса: уровень перекиси водорода, интенсивность ПОЛ и соотношение разных групп фотосинтетических пигментов оставалось на уровне контроля. Это становилось возможным благодаря функционированию в листьях данного вида мощной антиоксидантной системы. Было отмечено, что при произрастании A. platanoides в составе СЗН в его листьях происходило накопление глутатиона и фенольных соединений, а также увеличение активности гваяколовой пероксидазы и каталазы.

Список литературы

  1. Сравнительный анализ активности компонентов антиоксидантной системы древесных растений в условиях техногенного стресса / А.Р. Гарифзянов, С.В. Горелова, В.В. Иванищев, Е.Н. Музафаров // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2009. - С. 45-48.
  2. Оценка возможности использования древесных растений для биоиндикации и биомониторинга выбросов предприятий металлургической промышленности / С.В. Горелова, А.Р. Гарифзянов, С.М. Ляпунов, А.В. Горбунов, О.И. Окина, М.В. Фронтасьева // Проблемы биогеохимии и геохимической экологии. - 2010. - № 1(12). - С. 155-163.
  3. Грязнов В.П. Руководство к лабораторным и экспериментальным работам по физиологии растений. - Белгород: БелГУ, 2006. - 120 с.
  4. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. - М.: Наука, 1971. - С. 185-197.
  5. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivative stress: a review // Annals of Botany. - 2003. - Vol. 91. - P. 179-194.
  6. Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. - 1968. - Vol. 125(1). - P. 189-198.
  7. Kumar G.N., Knowles N.R. Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato (Solanum tuberosum L.) Seed-Tubers // Plant Physiol. - 1993. - Vol. 102. - P. 115-124.
  8. Lichtentaller H.K., Welburn A.R. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents // Biochem. Soc. Trans. - 1983. - Vol. 11, № 6. - P. 591-592.
  9. Prasad К.V.S.К., Saradhi P. P., Sharmila P. Concerted action of antioxidant enzymes and curtailed growth under zinc toxicity in Brassica juncea // Environmen. and Experimen. Botany. - 1999. - Vol. 42. - P. 1-10.
  10. Scandalios J.G. The rise of ROS // Trends Biochem. Sci. - 2002. - Vol. 27. - P. 483-486.

Рецензенты:

Кособрюхов А.А., д.б.н., с.н.с., руководитель группы экологии и физиологии фототрофных организмов, г. Пущино;

Субботина Т.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой медико-биологических дисциплин ТулГу медицинского института, г. Тула.

Работа поступила в редакцию 04.05.2011.