В настоящее время известно 25 селеновых белков млекопитающих, однако функции большинства из них до сих пор остаются неизученными. Ранее было показано, что SelV (Selenoprotein V) локализуется исключительно в семенниках, его С-концевой домен гомологичен другому селеновому белку млекопитающих SelW (Selenoprotein W) [8]. Кроме того, SelV входит в семейство редокс белков (Rdx), представители которого характеризуются наличием тиоредоксин-подобной укладки и консервативного мотива в своём каталитическом центре, что предполагает участие SelV в окислительно-восстановительных реакциях [5]. GPx6 (глутатионпероксидаза 6) является гомологом ранее охарактеризованных белков семейства глутатионпероксидаз. Согласно in situ гибридизации, GPx6 экспрессируется в Боуменовых железах, где синтезируются и секретируются многие компоненты обонятельной слизи. Кроме того, было показано, что GPx6 экспрессируется в тканях млекопитающих на ранних стадиях эмбрионального развития [8].
Целью исследования настоящей работы явилось определение внутриклеточной локализации белков SelV и GPx6 мыши, а также отдельно N-концевого и С- концевого доменов SelV в клеточной линии COS-7 (фибробласты почки обезьяны Cercopithecus aethiops).
Материал и методы исследования
Биоинформационный анализ
Поиск нуклеотидных и аминокислотных последовательностей исследуемых белков проводили в GenBank базе данных [3, 4]. Для составления прогноза внутриклеточной локализации SelV и GPx6 по его аминокислотной последовательности использовали программу PSORTII [1, 6, 7], наличие и расположение сигнальных последовательностей белков определяли с использованием программы SignalP [2].
Выделение нуклеиновых кислот
Выделение РНК из тканей семенников и обонятельного эпителия мыши проводили с помощью набора «RNeasy Mini Kit» («Qiagen», США). Образцы гомогенизировали в 600 мкл буфера, содержащего 4М гуанидин тиоционат и 1 % β-меркаптоэтанол. Полученный гомогенат использовали для выделения РНК.
Выделение плазмидной ДНК выполняли с помощью наборов «Plasmid Purification Mini Kit» и «Plasmid Purification Midi Kit» («Qiagen», США). Для высвобождения плазмидной ДНК бактериальные клетки подвергали щелочному лизису в присутствии 1 % додецилсульфата натрия. Полученный лизат нейтрализовали раствором 1М ацетата калия, pH 5.0 и наносили ДНК на мембрану колонки. Для удаления примесей адсорбированную ДНК промывали раствором, содержащим 1М хлорида натрия, 15 % изопропанола, 50мМ MOPS, pH 7.0. Очищенную плазмиду элюировали небольшим количеством Трис-буфера.
Методика проведения обратной транскрипции и ПЦР
Реакцию обратной транскрипции проводили по протоколу и с использованием реактивов, предоставленных «Fermentas» («RevertAidTM H Minus First cDNA Synthesis Kit»). Количество общей РНК в реакционной смеси составило 3 мкг. Реакцию проводили с использованием oligodT праймеров. Полученную кДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции.
Клонирование и сайт-направленный мутагенез
Для встраивания нуклеотидных последовательностей полноразмерного белка SelV и его доменов, ПЦР-фрагменты обрабатывали рестриктазами EcoRI и XhoI («Fermentas»). Клонирование открытой рамки считывания гена белка Gpx6 в вектор pEGFP-N2 ("Clontech") проводили с использованием рестриктаз EcoRI и ApaI («Fermentas»). Реакцию лигирования выполняли, используя T4 ДНК-лигазу («Fermentas»).
Реакции по сайт-направленному мутагенезу проводились с использованием реактивов и по протоколу, предложенному «Stratagene» («Quick Change Kit»).
Транзиентная трансфекция, иммуннофлуоресценция, конфокальная микроскопия
Для введения плазмидной ДНК в клетки млекопитающих использовали метод кальций-фосфатной трансфекции. Для этого 8.8 мкг плазмидной ДНК (на 105-107 клеток) инкубировали с 2М CaCl2 в 2х солевом буфере HEPES (280 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1,5 мМ Na2HPO4×2H2O, 12 мМ декстрозы, 50 мМ HEPES, pH 7.05) в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего вносили в клетки. Спустя 24 часа клетки отмывали от среды с помощью PBS (pH 7.4). Ядра клеток окрашивали 0,1 %-м раствором этидиума бромида в течение 5 минут, для определения митохондриальной локализации белков трансфецированные клетки инкубировали с красителем, селективно проникающим в митохондрии MitoTracker Deep Red 633 (Molecular Probe, USA). Фиксировали клетки раствором 4 %-м параформальдегида при 4 ºС в течение 5 минут. Результаты трансфекции визуализировали с помощью конфокального микроскопа «Leica TCS SP5».
Результаты исследований и их обсуждение
Ранее с помощью компьютерной программы «PSORTII», позволяющей предсказывать внутриклеточную локализацию белка по его первичной структуре, и программы «SignalP», определяющей наличие и расположение сигнальных последовательностей, нами установлено, что селеновый белок V не является секреторным и с вероятностью 65,2 % локализуется в митохондриях. Тогда как GPx6, согласно in silico анализу, является секреторным белком с вероятностью 66,7 %, что согласуется с ранее полученными данными о его локализации в обонятельном эпителии [8]. Программа «PSORTII» использует k-NN алгоритм (k-Nearest Neighbor) для поиска сайтов в первичной последовательности белков, обусловливающих их расположение внутри клетки. Однако данный поиск является не совсем эффективным в том случае, когда анализируемый белок не имеет выраженной сигнальной последовательности, что характерно и для SelV и GPx6.
Для того чтобы экспериментально проверить правильность результатов полученных in silico, селеноцистеин, находящийся в 255 положении открытой рамки считывания мышиного SelV, путем сайт-направленного мутагенеза был заменен на цистеин. Данная замена обусловлена особенностями встраивания селеноцистеина в синтезируемые полипептидные цепи напротив TGA кодона у эукариот, для которых характерно расположение SECIS-элемента в 3´-нетранслируемой области мРНК селенопротеиновых генов. Поскольку в данном эксперименте клонировали плазмиду, содержащую открытую рамку считывания гена SelV, не имеющую последовательности SECIS-элемента, то сайт-специфичная мутация позволила избежать терминации трансляции белка на 255 кодоне и синтезировать цистеиновый вариант SelV. Поскольку Gpx6 грызунов является цистеин-содержащим ортологом, не возникло необходимости проводить сайт-направленный мутагенез, сопровождающийся заменой селеноцистеинового кодона на цистеиновый с целью предотвращения преждевременной терминации трансляции.
Для визуализации результатов с помощью конфокальной микроскопии последовательности открытых рамок считывания SelV и его N-концевого (пролин-богатого) и C-концевого доменов, а также GPx6 были клонированы в составе вектора pEGFP-N2 («Clontech»). Вышеописанные химерные конструкции SelV были приготовлены для решения вопроса о том, какой из его доменов отвечает за внутриклеточную локализацию, поскольку сигнальная последовательность у разных белков может располагаться как на N-, так и на С-концах. Как было отмечено ранее, in silico анализ аминокислотной последовательности SelV выявил гомологию его С-концевого домена с известным селенопротеином W (SelW), который является цитоплазматическим белком, поэтому определить внутриклеточное расположение данного домена SelV представляло особенный интерес. Схематично варианты химерных конструкций отдельно SelV и его доменов, а также GPx6 в составе вектора pEGFP-N2 представлены на рис. 1 А и Б.
Рис. 1. Схематическое изображение химерных конструкций, включающих SelV, его домены
и GPX6 в составе вектора pEGFP-N2 («Clontech»):
А - 1 - GFP-контроль; 2 - последовательность открытой рамки считывания
SelV (Sec->Cys) с GFP; 3 - последовательность пролин-богатого домена SelV с GFP;
4 - последовательность C - концевого SelW-гомологичного домена с GFP;
Б - последовательность открытой рамки считывания GPx6 с GFP
Визуализация результатов с помощью конфокальной микроскопии не выявила существенных отличий во внутриклеточной локализации полноразмерного SelV и двух его доменов (рис. 2, А). Наблюдается равномерное распределение белков в цитоплазме клеток и некоторое накопление этих белков, по сравнению с контролем, в структурах ядра.
В отличие от относительно диффузного распределения SelV в цитоплазме клеток, локализация GPx6 не является равномерной, данный белок экспрессируется в определенных клеточных органеллах - предположительно, в митохондриях (рис. 2, Б).
Для того чтобы проверить возможность экспрессии исследуемых белков в митохондриях, были проведены эксперименты по их ко-локализации с красителем, специфично окрашивающим эти клеточные органеллы. Представленные на рис. 3, А и Б результаты данной серии экспериментов свидетельствуют об отсутствии ко-локализации SelV и GPx6 с митохондриальным красителем.
Заключение
В данной работе определена локализация новых селеновых белков млекопитающих SelV и его N- и C-концевого доменов, а также GPx6 в клетках линии COS-7. Результаты, полученные с помощью конфокальной микроскопии, показали, что SelV и GPx6 являются цитоплазматическими белками, не локализующимися в митохондриях. Поскольку внутриклеточное распределение N- и C-концевого доменов не отличается от такового для SelV, можно заключить, что в первичной последовательности SelV отсутствуют сигнальные пептиды, обеспечивающие посттрансляционный транспорт данного белка, в частности, в митохондрии, что не согласуется с in silico предсказанием, выполненным при помощи программы PSORTII. Таким образом, подобно SelW, селенопротеин V имеет преимущественно цитоплазматическую и частично, по сравнению с контролем, ядерную локализацию.
Рис. 2. Внутриклеточная локализация SelV, его доменов и GPx6 в клетках млекопитающих линии COS-7:
А - 1 - локализация GFP в клетках, трансфецированных вектором pEGFPN2 («Clontech») (контрольный образец); 2 - клетки, трансфецированные вектором pEGFPN2(«Clontech»), содержащим последовательность SelV; 3 - клетки, трансфецированные вектором pEGFPN2, содержащим последовательность N-концевого домена SelV; 4 - клетки, трансфецированные вектором pEGFPN2, содержащим последовательность С-концевого домена SelV.
Нижний ряд фотографий: ядра клеток, прокрашенные 0,1 % этидиум бромидом;
средний ряд: локализация вышеописанных рекомбинантных белков совместно с GFP; верхний ряд: совмещение фотографий нижнего и среднего рядов; Б - внутриклеточная локализация GPx6.
Справа-налево: ядра клеток, прокрашенные 0,1 % этидиум бромидом;локализация GPx6 совместно с GFP;совмещение этих фотографий
Рис. 3. Определение локализации белков SelV в GPx6, находящихся в составе вектора pEGFPN2 («Clontech») в митохондриях клеток млекопитающих линии COS-7:
А - локализация GFP в клетках, трансфецированных вектором pEGFPN2 («Clontech») (контрольный образец); Б - локализация SelV, совмещенного с GFP; В - локализация GPx6, совмещенного с GFP; 1 - локализация вышеописанных рекомбинантных белков совместно
с GFP; 2 - митохондрии клеток, инкубированные с красителем, селективно проникающим
в митохондрии; 3 - совмещение фотографий 1 и 2
Список литературы
- Extensive feature detection of N-terminal protein sorting signals / H. Bannai et al. // J. Bioinformatics. - 2002. - Vol. 18, №2. - P. 298-305.
- Improved predictions of signal peptides: SignalP 3.0 / J.D. Bendtsen et al. // J. Mol. Biol. - 2004. - Vol. 340, №4. - P. 783-795.
- GenBank / D.A. Benson, I. Karsch-Mizrachi, D.J. Lipman, J. Ostell, D.L. Wheeler // Nucleic Acid Res. - 2006. - Vol. 34. - P. 16-20.
- Benton D.A. Recent changes in the GenBank On-line Service //J. Nucleic Acid Res. - 1990. - Vol.18, №6. - P. 1517-1520.
- SelT, SelW, SelH, and Rdx12: genomics and molecular insights into the functions of selenoproteins of a novel thioredoxin-like family / A. Dikiy, S.V. Novoselov, D.E. Forenoon, A. Sengupta, B.A. Carlson, R.L. Cerny, K. Ginalski, N.V. Grishin, D.L. Hatfield, V.N. Gladyshev // J. Biochemistry. - 2007. - Vol. 46. - P. 6871-6882.
- Predicting subcellular localization of proteins based on their N- terminal amino acid sequence / O. Emanuelsson et al. // J. Mol. Biol. - 2000. - Vol. 300, №4. - P. 1005-1016.
- Horton P., Nakai K. Better prediction of protein cellular localization sites with the k nearest neighbors classifier // J. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. - 1997. - Vol. 5. - P. 147-152.
- Characterization of mammalian selenoproteomes / G.V. Kryukov, S. Castellano, S.V. Novoselov, A.V. Lobanov, O. Zehtab, R. Guigoґ, V.N. Gladyshev // J. Science. - 2003. - Vol. 300. - P. 1439-1443.
Рецензенты:
Озолинь О.Н., д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник Института биофизики клетки РАН, г. Пущино;
Новоселова Е.Г., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник Института биофизики клетки РАН, г. Пущино.
Работа поступила в редакцию 28.04.2011.