Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Несмотря на развитие травматологии и ортопедии, полное восстановление костной и хрящевой ткани является проблемным, поскольку большие дефекты не могут спонтанно заживать. Использование стволовых клеток - это регенеративная биология и регенеративная медицина, являющиеся все более расширяющимися областями исследования с надеждой на успех терапевтических методов лечения ран и травм, на которые невозможно эффективно воздействовать современными хирургическими методами [2, 4, 5].

Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (мезенхимальные стволовые клетки), способные к дифференцировке в кость, хрящ, сухожилия и другие виды соединительной ткани, что позволяет широко применять такие клетки для ускорения регенерации костной ткани [2, 6, 7, 9].

Использование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) приводит к ускорению регенерации поврежденных костей, увеличению их плотности, по сравнению с результатами при естественном течении репаративных процессов [3, 10, 11, 15].

В связи с вышеизложенным, в эксперименте на крысах изучали процессы регенерации участка повреждения кости нижней челюсти крыс в различное время после введения суспензии аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения (АМСККМП) в культуральной среде.

Материал и методы исследования

В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag весом 180-200 г возрастом 6 месяцев. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На каждую точку исследования было использовано не менее 10 животных.

Модель дефекта костной ткани [1, 12] и применения АМСККМП в эксперименте:

Под общим ингаляционным эфирным наркозом, в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики, после обработки кожи спиртом скальпелем производили разрез кожи длиной 1,5-2 см по нижнему краю нижней челюсти. Тупым способом при помощи распатора отслаивали жевательную мышцу и обнажали поверхность кости нижней челюсти в области ее угла. Стоматологическим бором делали круглое отверстие диаметром 2 мм в кости угла нижней челюсти, с полостью рта дефект кости не сообщался. Затем послойно ушивали рану викрилом.

Животные были разделены на 2 группы в зависимости от хода регенерации участка поврежденной кости нижней челюсти:

1-я группа - естественное течение репаративного процесса - 70 крыс;

2-я группа - репарация на фоне введения в искусственный дефект нижней челюсти 100 мкл суспензии АМСККМП в культуральной среде (1´106 клеток в 1 мл) - 70 животных.

АМСККМП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей у крыс-самцов линии Wag. Полученную суспензию клеток помещали в пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 ч после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде α-МЕМ с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37 °С в СО₂ - инкубаторе с 5 % СО₂ в условиях насыщенной влажности. Смену среды производили каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рассевали в плотности 1000-5000 клеток/см2 (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), используя стандартные растворы Версена и трипсина.

Методами световой и флуоресцентной микроскопии и цитологическими методами окрашивания было показано, что культивируемые клетки костного мозга крысы:

- были CD90+, CD105+, CD34-, CD45-,

- in vitro прикреплялись к поверхности пластика культивирования,

- имели фибробластоподобную морфологию, которую сохраняли все время культивирования,

- поддерживались в культуре в течение нескольких пересевов,

- формировали колонии фибробластоподобных клеток при посеве в низкой плотности,

- в присутствии линейно-специфичных факторов дифференцировались в клетки костной ткани.

Для исследования использовали клетки 2-3 пассажей.

Однако физические, морфологические и фенотипические признаки также не являются специфическими критериями, которые могут быть использованы для специфической идентификации АМСККМП. Способность АМСККМП к индуцированной дифференцировке in vitro в кости, жир и хрящ является единственным критическим требованием для определения предполагаемых популяций стволовых клеток.

Индукция остеогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток in vitro: Поскольку АМСККМП свойственна дифференцировка в клетки костной ткани и условия ее проведения наиболее воспроизводимы, этот вид дифференцирования обычно используется для характеристики культур стволовых клеток in vitro и он является типичным заданным по умолчанию путем развития для большинства АМСККМП в культуре. Для индукции остеогенной дифференцировки использовали 0,1 µM дезоксиметазон, 50 µM аскорбиновую кислоту и 10 mM β-глицерофосфат («Sigma», США), вызывающие остеогенную дифференцировку.

Остеогенную дифференцировку определяли по 2 маркерам: по активности щелочной фосфатазы и минерализации межклеточного матрикса ионами кальция. Цитохимическое выявление щелочной фосфатазы проводили с использованием нитротетразолиевого синего в присутствии субстрата щелочной фосфатазы 5-бромо-4-хлоро-3-индолила. Накопление кальция в межклеточном матриксе регистрировали по окрашиванию Ализарином красным.

Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 3, 4 и 5 недель после операции. Участок нижней челюсти с искусственно созданным дефектом фиксировали в 4 %-м растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 часов.

При оценке результатов методом рентгеновской денситометрии использовали фиксированные и препарированные фрагменты нижней челюсти крыс с удаленной кожей и подкожной клетчаткой. В компьютере радиовизиографа (Россия, 2004) установлена программа по исследованию плотности костной ткани, которая представлена в условных единицах: (отношение полученных данных плотности кости в участке повреждения к результатам исследования аналогичных неповрежденных участков на контрлатеральной стороне). Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel (Microsoft, USA), определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение. Различия между средними считали достоверными при p < 0,05.

Далее фрагменты нижней челюсти декальцинировали в растворе «Биодек R» (Bio Optica Milano, Италия) в течение суток, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по Романовскому, изучали при увеличении светового микроскопа Axioimager M1 (Zeiss, Германия) до 1200 раз.

Результаты исследования и их обсуждение

Через 1 неделю после повреждения кости нижней челюсти при спонтанной регенерации было найдено, что отверстие частично заполнено кровью, на некоторых участках в дефекте кости уже присутствовали фрагменты рыхлой волокнистой соединительной ткани и грануляции. Следует отметить начало образования кости в дефекте (формирование отдельных островков молодой кости и хряща среди грануляций). Кроме того, было найдено присутствие нежизнеспособных фрагментов костной ткани, скорее всего, образованных при создании дефекта (опилки). Вокруг этих фрагментов были расположены макрофаги и многоядерные клетки, видимо, остеокласты или гигантские клетки инородных тел, сформированные для лизиса крупных фрагментов нежизнеспособных тканей.

Через 2 недели после создания дефекта кости нижней челюсти отверстие было полностью закрыто молодой костной тканью с большим числом полнокровных кровеносных сосудов по краю дефекта. Среди вновь образованных структур часто присутствовала хрящевая ткань, особенно в центре искусственного отверстия.

На 3 неделе после повреждения кости нижней челюсти отверстие было полностью закрыто вновь образованной костной тканью. О месте операции можно было судить по оставшимся крупным сосудам и хаотично расположенным костным балкам (костная мозоль). Иногда кость в дефекте практически не отличалась от окружающей ткани, однако расположенные в некоторых участках структуры костной мозоли позволяли найти место хирургического вмешательства (рис. 1а, б).

Через 4 недели в большинстве случаев самостоятельного заживления только по следам костной мозоли можно было найти место операции. К этому моменту появились полностью сформированные полости с костным мозгом. В одном наблюдении практически все отверстие кости представляло собой полость, заполненную красным костным мозгом, где присутствует много крупных полнокровных кровеносных сосудов.

Спустя 5 недель в контроле отверстие было полностью закрыто костной тканью со следами образования костной мозоли.

На фоне введения АМСККМП в культуральной среде спустя 1 неделю дефект кости полностью заполнен кровью, между кровяным сгустком и краем дефекта были найдены типичные грануляции. Необходимо отметить начало образования кости в дефекте (формирование отдельных островков молодой кости и хряща среди грануляций). То есть состояние тканей в дефекте кости на этот срок практически соответствует контролю, однако, следует обратить внимание на значительно большее число кровеносных сосудов в структурах, заполняющих отверстие в кости, в том числе и в грануляциях.

На 2-й неделе после введения АМСККМП отверстие в кости нижней челюсти было полностью замещено молодой костной и хрящевой тканью (множество слившихся островков) с большим содержанием полнокровных тонкостенных кровеносных сосудов. Необходимо отметить формирование структур красного костного мозга уже на этот срок. На некоторых участках можно было найти отдельные небольшие фрагменты различных типов соединительной ткани с крупными тонкостенными кровеносными сосудами и большими многоядерными клетками, скорее всего, мегакариоцитами, что является одним из признаков развития красного костного мозга. То есть к этому времени наблюдали резкое ускорение процессов, приведшее к быстрому развитию или регенерации в костной мозоли гемопоэтической структуры - костного мозга (рис. 2а, б).

Рис. 1. Естественное течение репаративной регенерации участка повреждения кости нижней челюсти спустя 3 недели после операции. Окраска гематоксилином и эозином:
а - дефект заполнен молодой костной тканью, где присутствует красный костный мозг;
б - фрагмент рис. 1а на большом увеличении, начало формирования полостей с красным костным мозгом в молодой костной ткани

Через 3 недели после введения АМСККМП в культуральной среде дефект кости был полностью замещен слившимися островками молодой костной ткани также со структурами красного костного мозга между ними.

На срок в 4 и 5 недель после введения АМСККМП в культуральной среде в большинстве случаев отверстие в кости было полностью закрыто костной мозолью с полностью сформировавшимися структурами красного костного мозга между ними.

Рис. 2. Результаты применения АМСККМП спустя 2 недели после операции.
Окраска гематоксилином и эозином:
а - отверстие нижней челюсти полностью замещено молодой костной тканью со сформированными структурами красного костного мозга между ними;
б - фрагмент рис. 2а на большом увеличении, в цитограмме костного мозга на некоторых участках присутствуют большие многоядерные клетки - мегакариоциты (указано стрелкой)

После статистической обработки данных денситометрии процессов регенерации дефекта кости нижней челюсти крыс при естественном заживлении и после применения АМСККМП было обнаружено отсутствие достоверных различий плотности тканей в очаге между сравниваемыми группами животных на каждую точку исследования. Однако плотность тканей и при естественном ходе репаративных процессов, и на фоне использования АМСККМП статистически значимо была меньше, чем в здоровой кости на 2-й неделе на 11 и 10,7 % соответственно, а через 5 недель - на 9,5 и 16,8 % также соответственно. То есть плотность тканей в участке повреждения на эти сроки была на уровне или даже меньше, чем спустя 1 неделю после операции (рис. 3) (таблица).

Рис. 3. Участок повреждения кости нижней челюсти через 5 недель после операции по данным радиовизиографического исследования. Искусственно созданное отверстие указано стрелкой:
а - естественное течение репаративной регенерации спустя 5 недель после операции, дефект кости сохраняется, плотность тканей в участке повреждения приближается к плотности на соседних участках; б - регенерация поврежденной кости нижней челюсти в условиях использования суспензии АМСККМП, дефект кости сохраняется, плотность тканей меньше,
по сравнением с состоянию при естественной репарации, полость в кости шире

Кроме этого необходимо отметить, что на 4-й и 5-й неделях наблюдения плотность тканей в участке повреждения после применения АМСККМП была несколько меньше, относительно состояния при спонтанном заживлении, причем спустя 5 недель эти различия были более выраженными
(см. рис. 3) (таблица).

На фоне введения АМСККМП в культуральной среде спустя 1 неделю состояние тканей в дефекте кости практически соответствует контролю, однако, было найдено значительно большее число кровеносных сосудов в структурах, заполняющих отверстие в кости, в том числе и в грануляциях.

Плотность кости в дефекте нижней челюсти относительно окружающих неповрежденных тканей при регенерации дефекта нижней челюсти
в условиях введения АМСККМП (M ± m)

Примечание: * - величины, достоверно отличающиеся от интактной кости контрлатеральной стороны (р < 0,05); 2, 3 - величины, достоверно различающиеся между собой в данных колонках (р < 0,05).

На 2 неделе после введения АМСККМП необходимо отметить формирование красного костного мозга уже на этот срок. То есть к этому времени наблюдали резкое ускорение процессов, приведшее к быстрому развитию или регенерации в костной мозоли гемопоэтической структуры - костного мозга.

На последующие сроки происходило дальнейшее слияние островков костной ткани с последующим формированием костной мозоли и прогрессирующее восстановление красного костного мозга.

Согласно литературным данным, мезенхимальные стромальные (стволовые) клетки формируют строму костного мозга, а гемопоэтические стволовые клетки участвуют в регенерации красного костного мозга. Поэтому не происходит образования костного мозга при введении только гемопоэтических клеток в различные участки те-
ла [13]. Однако в последнее время появились данные о возможности трансдифференцировки гематопоэтических клеток костного мозга в тканеспецифичные стволовые клетки и обратно [14].

Введение в моделях на грызунах суспензии МСК и деминерализованного костного матрикса в пустую костномозговую полость трубчатой кости привело к образованию трабекул и стромы, поддерживающей гематопоэз [8]. После применения графта из композиции гидроксиапатита и коллагенового геля с МСК для замещения средней трети бедренной кости у кроликов, кроме формирования новой костной ткани с постепенной биодеградацией искусственного материала, были найдены структуры костного мозга [3].

Так как в данном эксперименте были использованы МСК костномозгового происхождения, не исключено присутствие среди них небольшого числа гемопоэтических клеток. Видимо, за счет действия этих клеточных элементов и объясняется быстрая и ранняя регенерация гемопоэтической структуры - красного костного мозга. Необходимо отметить возможность трансдифференцировки АМСККП в гемопоэтические стволовые клетки [14].

По результатам денситометрии дефекта кости нижней челюсти крыс при естественном заживлении и после применения АМСККМП, было обнаружено, что плотность тканей статистически значимо отличалась от здоровой кости на 2-й и 5-й неделях. При этом спустя 4-й и 5-й недель после операции плотность кости в дефекте на фоне применения АМСККМП была меньше, чем при естественном ходе репаративного процесса.

На основании данных литературы [3, 10, 11, 15], мы ожидали ускорения регенерации поврежденной кости и соответственно большей ее плотности, по сравнению с результатами денситометрии челюсти при естественном течении репаративных процессов.

Скорее всего, падение плотности в очаге, по данным денситометрии, на 2-й и 5-й неделях после операции в обеих группах связано с развитием красного костного мозга. На 1-й неделе идет активное развитие кости и было отмечено повышение плотности, далее формируется красный костный мозг, который расположен в полостях и соответственно плотность костной ткани падает. После введения АМСККМП костный мозг образуется быстрее и более выражен, поэтому значительнее уменьшается плотность костной ткани в участке повреждения и становится даже ниже, чем при заживлении без использования клеток. Однако следует учитывать возможность снижения прочностных свойств восстановленной кости из-за присутствия больших полостей, заполненных костным мозгом.

Таким образом, основные особенности регенерации участка повреждения кости нижней челюсти крыс в условиях введения АМСККМП заключаются в значительно более раннем появлении структур красного костного мозга в формирующейся костной мозоли. Эти изменения прогрессируют в течение всего времени наблюдения и являются свидетельством ускоренного развития репаративных процессов.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы Фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект № 21.31 «Разработка технологий управления процессами регенерации костных тканей с применением биодеградируемых полимеров»).

Заключение

Таким образом, на основании вышеизложенного можно сделать заключение, что после применения АМСККМП в костной мозоли значительно раньше формируются структуры красного костного мозга, чем при естественном ходе регенерации. Образование полостей с костным мозгом приводит к тому, что на 4-й и 5-й неделях наблюдения плотность тканей в участке повреждения после применения АМСККМП меньше, относительно состояния при спонтанном заживлении. Указанные изменения прогрессируют в течение всего времени наблюдения и являются свидетельством ускоренного развития репаративных процессов. Однако возможно снижение прочностных свойств восстановленной кости из-за присутствия больших полостей, заполненных костным мозгом.

Список литературы

1. Субмандибулярные лимфатические узлы крыс с артериальной гипертензией после повреждения кости нижней челюсти / И.В. Майбородин, И.С. Колесников, Д.М. Козодий, М.С. Выборнов, М.Н. Дровосеков // Стоматология. - 2010. - Т. 89, № 5. - С. 11-14.
2. Chanda D., Kumar S., Ponnazhagan S. Therapeutic potential of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells in diseases of the skeleton // J. Cell. Biochem. - 2010. - Vol. 111, № 2. - P. 249-257.
3. Fabrication of vascularized bone grafts of predetermined shape with hydroxyapatite-collagen gel beads and autogenous mesenchymal stem cell composites / S.H. Chang, K.Y. Tung, Y.J. Wang, Y.P. Tsao, T.S. Ni, H.K. Liu // Plast. Reconstr. Surg. - 2010. - Vol. 125, № 5. - P. 1393-1402.
4. Clines G.A. Prospects for osteoprogenitor stem cells in fracture repair and osteoporosis. // Curr. Opin. Organ. Transplant. - 2010. - Vol. 15, № 1. - P. 73-78.
5. Mesenchymal stem cells in cartilage repair: state of the art and methods to monitor cell growth, differentiation and cartilage regeneration / J. Galle, A. Bader, P. Hepp, W. Grill,B. Fuchs, J.A. Käs, A. Krinner, B. Marquaß, K. Müller, J. Schiller, R.M. Schulz, M. Buttlar von, E. Burg von der, M. Zscharnack, M. Löffler // Curr. Med. Chem. - 2010. - Vol. 17, № 21. - P. 2274-2291.
6. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells / C. Goepfert, A. Slobodianski, A.F. Schilling, P. Adamietz, R. Pörtner // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. - 2010. - Vol. 123. - P. 163-200.
7. Potential applications for using stem cells in spine surgery / T. Goldschlager, G. Jenkin, P. Ghosh, A. Zannettino, J.V. Rosenfeld // Curr. Stem Cell. Res. Ther. - 2010. - Vol. 5, № 4. - P. 345-355.
8. Reconstruction of cartilage, bone, and hematopoietic microenvironment with demineralized bone matrix and bone marrow cells / O. Gurevitch, B.G. Kurkalli, T. Prigozhina, J. Kasir, A. Gaft, S. Slavin // Stem Cells. - 2003. - Vol. 21, № 5. - P. 588-597.
9. Genetically engineered mesenchymal stem cells: The ongoing research for bone tissue engineering / D. Hong, H.X. Chen, R. Ge, J.C. Li // Anat. Rec. (Hoboken). - 2010. - Vol. 293, № 3. - P. 531-537.
10. Quantitative, structural, and image-based mechanical analysis of nonunion fracture repaired by genetically engineered mesenchymal stem cells / I.Kallai, G.H. van Lenthe, D. Ruffoni, Y. Zilberman, R. Müller, G. Pelled, D. Gazit // J. Biomech. - 2010. - Vol. 43, № 12. - P. 2315-2320.
11. Kumar S., Nagy T.R., Ponnazhagan S. Therapeutic potential of genetically modified adult stem cells for osteopenia // Gene Ther. - 2010. - Vol. 17, № 1. - P. 105-116.
12. Experimental results of the fibrin clot use to accelerate the regeneration of damaged bone in the rat lower jaw / I. Maiborodin, A. Shevela, T. Perrin, I. Kolesnikov, V. Matveeva, A. Shevela, B. Sheplev, I. Kolmakova, M. Drovosekov // Surgical Science. - 2010. - Vol. 1, № 1. - P. 1-6.
13. Patt H.M., Maloney M.A. Bone marrow regeneration after local injury: a review // Exp. Hematol. - 1975. - Vol. 3, № 2. - P. 135-148.
14. Stem cell plasticity revisited: CXCR4-positive cells expressing mRNA for early muscle, liver and neural cells ‘hide out´ in the bone marrow / M.Z. Ratajczak, M. Kucia, R. Reca, M. Majka, A. Janowska-Wieczorek, J. Ratajczak // Leukemia. - 2004. - Vol. 18, № 1. - P. 29-40.
15. Neo-vascularization and bone formation mediated by fetal mesenchymal stem cell tissue-engineered bone grafts in critical-size femoral defects / Z.Y. Zhang, S.H. Teoh, M.S. Chong, E.S. Lee, L.G. Tan, C.N. Mattar, N.M. Fisk, M. Choolani, J. Chan // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31, № 4. -P. 608-620.

Рецензенты:

Склянов Ю.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Новосибирск;

Бгатова Н.П., д.б.н., профессор, зав. лабораторией ультраструктурных исследований НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 04.05.2011.