Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

THE COMPARATIVE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF CEPHALOSPORINE ANTIBIOTICS, MODIFIED BY MECHANICAL BREAKING WITH SORBTION ON NANOSTRUCTURED PARTICLES OF SILICON DIOXIDE

Душкин А.В., Лыков А.П., Ларина О.Н., Гуськов С.А., Евсеенко В.И., Гольдина И.А., Сафронова И.В., Гайдуль К.В., Ляхов Н.З., Козлов В.А.
It has been studied the antimicrobial activity of cephalosporine antibiotics, mechanically modified with sorption on nanostructured particles of colloidal silicon dioxide on the base of growth dynamics of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli in vitro. The effectiveness of using of these modifications of antibiotics for the enhancement of their antibacterial activity has been shown. Keywords: antimicrobial activity, nanoparticles, colloidal silicon dioxide, mechanical breaking, antibiotics

В основе эффективного лечебного действия антибактериальных препаратов лежат высокая чувствительность к ним возбудителей заболеваний, возможность создания терапевтически значимой концентрации антибиотика в очаге поражения, минимальное побочное действие на организм больного. В настоящее время общепризнанным является увеличение количества штаммов микроорганизмов, резистентных к антибиотикам, а также нарастание патогенных свойств сапрофитных и потенциально патогенных микроорганизмов, что определяет необходимость создания новых, более эффективных антибактериальных препаратов [1]. Поиск путей преодоления резистентности микроорганизмов к антибиотикам является актуальной задачей современной фармакологии. Одним из возможных решений данной проблемы является наделение существующих антибиотиков новыми физико-химическими свойствами, различными методами модификации [2]. Развиваемая в ИХТТМ СО РАН, твердофазная, не требующая участия жидких фаз, механохимическая технология получения супрамолекулярных систем лекарственных веществ с веществами - «носителями» продемонстрировала свою эффективность для повышения их фармакологической активности и безопасности [3, 7]. Диоксид кремния (SiO2) рассматривается как перспективный биосовместимый, биодеградируемый материал - «носитель», не обладающий цитотоксичностью, способный пенетрировать через мембраны различных клеток, для создания на его основе лекарственных препаратов с контролируемым тканеспецифическим или интрацеллюлярным высвобождением [10].

Целью данного исследования являлась сравнительная оценка антибактериальной активности цефалоспоринов, модифицированных механохимической обработкой смесей антибиотик/SiO2, сопровождающейся иммобилизацией антибиотика на наноструктурированных частицах SiO2, с их официнальными формами in vitro.

Материал и методы исследования

Модификация цефалоспориновых антибиотков III-IV поколения - цефтазидима, цефотаксима, цефепима, цефтриаксона, осуществлялась механической обработкой смесей антибиотиков и коллоидного диоксида кремния (энтеросорбент «Полисорб» (ЗАО «Полисорб», Россия)) в шаровой мельнице (энергонапряженность 1g) в массовых соотношениях антибиотик/SiO2 - 30:1. Гранулометрический состав водных суспензий исходного наноструктурированного SiO2 (нано-SiO2) и его композиций с антибиотиками определяли на лазерном гранулометре Micro-Sizer 201 (Россия). Концентрации водных растворов антибиотиков исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1200 (США). Степень сорбции антибиотика коллоидным диоксидом кремния оценивали по количеству антибиотика, десорбировавшегося в водную фазу из SiO2, осажденного центрифугированием водных суспензий механохимически полученных композиций.

Изучение антимикробной активности антибиотиков производилось in vitro, на основании динамики роста культуры ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в мясо-пептонном бульоне (МПБ). Определение минимальной ингибирующей дозы (МИК) проводилось методом двукратных серийных разведений. Антибактериальную активность антибиотиков оценивали в диапазоне концентраций от 0,03 до 128 мкг/мл. Препараты предварительно разводили в физиологическом растворе хлорида натрия. Тестирование роста бактерий осуществляли в 5 мл каждого разведения антибиотика с конечной концентрацией микроорганизмов 5⋅105 микробных тел/мл. В соответствии с рекомендациями [4] контроль роста в присутствии растворителя не производился. В качестве контроля роста бактерий в МПБ использовали образцы, содержащие среду и тестируемые штаммы без антибиотиков. Культуры помещали в термостат на 24 часа при 37 °С, после чего учитывали наличие или отсутствие роста микроорганизмов и определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), то есть наименьшую концентрацию антибиотика, подавляющую видимый рост бактерий. Использовали следующие контрольные штаммы микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa ATCC № 27853, Staphylococcus aureus ATCC № 25923, Escherichia coli ATCC № 25922, полученных из ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Данные представляли в виде медианы (Me), границ нижнего и верхнего квартиля (Lq-Hq), достоверность различий рассчитывалась по U-критерию Манна - Уитни и принималась при значениях p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Структурные характеристики получаемых композиций.

Использованный нами материал коллоидного аморфного диоксида кремния, согласно электронно-микроскопическим исследованиям, состоял из округлых наночастиц размером 20-100 нм, агрегированных в рыхлые агрегаты размером 5-100 мкм. В водной среде агрегаты частично разрушались, образуя суспензию с частицами нано-SiO2 размером 5-20 мкм. При механохимическом получении композиций с антибиотиками происходило дальнейшее уменьшение размеров агрегатов, то есть в механохимически полученных композициях удавалось существенно (приблизительно в 50 раз, до 36 вес. %) увеличить массовую долю мелких (менее 3-5 мкм), потенциально наиболее биологически активных фракций частиц - носителей.

Иммобилизация антибиотиков частицами диоксида кремния.

Мы провели оценку количества антибиотиков, сорбированных на наноструктурированных частицах коллоидного диоксида кремния. Экспериментально определенная степень сорбции исследованных антибиотиков, определяемая как отношение массы антибиотика к массе нано-SiO2 в полученных композициях, при массовом соотношении антибиотик/нано-SiO2 = 30/1, колеблется в пределах 35-45 вес. %. Учитывая неточность примененного метода (±15 %), степень сорбции была условно одинакова для всех антибиотиков. Такая относительно неизменная степень сорбции и легкость высвобождения сорбированного антибиотика, по нашему мнению, указывает на объемный механизм сорбции за счет эффекта мезопористости использованного материала нано-SiO2, то есть концентрационном накоплении антибиотика в порах частиц коллоидного диоксида
кремния.

Следовательно, независимо от возможного механизма сорбции, механохимическая обработка композиций позволяет многократно увеличить массовую и, соответственно, количественную долю малоразмерных фракций частиц нано-SiO2 и, тем самым, увеличить количество молекул антибиотиков, сорбированных наиболее биологически активными микро- и наноразмерными частицами, проникающими в бактериальные клетки.

Изучение антибактериальной активности.

Результаты двух независимых экспериментов по исследованию антибактериальной активности официнальных и модифицированных форм цефалоспоринов при серийных разведениях в МПБ представлены в таблице.

Уровни минимальной ингибирующей концентрации официнальных и модифицированных форм цефалоспориновых антибиотиков в тесте серийных разведений
в мясо-пептонном бульоне (Ме (25; 75 %))

Штамм микроорганизмов

Цефтазидим

Цефотаксим

Цефепим

Цефтриаксон

О.ф.- (1), n = 4      

М.ф. (2), n = 4   

О.ф.- (1), n = 4

М.ф. (2), n = 4  

О.ф.- (1), n = 4     

М.ф. (2), n = 4     

О.ф. - (1), n = 4   

М.ф. (2), n = 4  

Staphylococcus aureus

32,0

(32,0-32,0)

8,0

(8,0-8,0)*

4,0

(4,0-4,0)

0,5

(0,5-0,5)*

4,0

(4,0-4,0)

4,0

(4,0-4,0)

4,0

(4,0-4,0)

4,0

(4,0-4,0)

Pseudomonas aeruginosa

16,0

(16,0-16,0)

4,0

(4,0-4,0)*

4,0

(4,0-4,0)

4,0

(4,0-4,0)

16,0

(16,0-16,0)

1,0

 (1,0-1,0)*

4,0

 (4,0-4,0)

0,5

(0,5-0,5)*

Escherichia coli

16,0

(16,0-16,0)

4,0

(4,0-4,0)*

4,0

(4,0-4,0)

4,0

(4,0-4,0)

16,0

(16,0-16,0)

1,0

 (1,0-1,0)*

4,0

 (4,0-4,0)

0,5

(0,5-0,5)*

Примечание: О.ф. - официнальная форма антибиотика, М.ф. - модифицированная форма антибиотика; * - достоверность различий между формами антибиотика (p < 0,05).

При исследовании динамики роста Staphylococcus aureus выявлено статистически значимое различие в концентрации, вызывающей задержку роста в тесте серийных разведений антибиотиков в МПБ для цефтазидима и цефотаксима. МИК модифицированных форм цефтазидима и цефотаксима была меньше, чем при использовании официнальных форм данных антибиотиков. При изучении МИК для Pseudomonas aeruginosa было обнаружено, что модифицированный цефтазидим, цефепим и цефтриаксон подавляли рост микроорганизма в статистически значимо более низких концентрациях, по сравнению с официнальными формами.

Изучение МИК модифицированных форм антибиотиков в отношении Escherichia coli показало, что концентрация цефтазидима, цефепима и цефтриаксона, по сравнению с их официнальными формами, была меньшей (p < 0,05).

Таким образом, модифицированный цефтазидим обладал более выраженной антимикробной активностью в отношении всех трех штаммов изученных микроорганизмов. Модифицированная форма цефепима и цефтриаксона характеризовалась большей антимикробной активностью, по сравнению с официнальной, в отношении Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Модифицированный цефотаксим был более активен в подавлении видимого роста Staphylococcus aureus.

Полученные нами результаты исследования антимикробной активности антибиотиков, модифицированных механическим измельчением с сорбцией на нано-SiO2, согласуются с представленными в литературе данными о большей эффективности гентамицина, конъюгированного с наночастицами биодеградируемой золь-гелиевой тетраэтилортосилики [9]. Сообщается также о повышении антибактериальной активности антибиотиков, конъюгированных с наночастицами серебра и золота [5, 8]. Так, наночастицы золота, покрытые цефалоспориновым антибиотиком II поколения - цефаклором, обладают более высокой антимикробной активностью по отношению к Staphylococcus aureus и Escherichia coli, по сравнению с нативным цефаклором, причем антимикробная активность обусловлена сочетанным действием входящих в этот комплекс исходных веществ. Антибиотик, ингибирует синтез пептидогликанов, а наночастицы золота формируют поры в клеточной стенке бактерий, что в конечном итоге приводит к гибели микроорганизмов [8]. На примере комплекса из хитозана с наночастицами золота и ампициллина было показано, что данная композиция обладает в 2 раза большей антимикробной активностью, по сравнению с официнальной формой данного антибиотика [6].

Заключение

В результате применения механохимической технологии получения композиций антибиотик/нано-SiO2 происходит многократное увеличение доли наиболее биологически активных частиц нано-SiO2, которые являются «носителями» антибиотика, что приводит к увеличению антибактериальной активности полученных композиций, на основании уменьшения минимальной ингибирующей концентрации роста микроорганизмов in vitro. Таким образом, модификация антибиотиков группы цефалоспоринов - цефтазидима, цефепима, цефотаксима, цефтриаксона, методом механохимической обработки их смесей с коллоидным диоксидом кремния является перспективным методом повышения их антибактериальной активности.

Список литературы

  1. Богомолова Н.С. Перспективы использования нового цефалоспоринового антибиотика четвертого поколения в хирургии / Н.С. Богомолова, Т.Д. Орешкина, Л.В. Большаков // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т. 48, № 7. - С. 7-11.
  2. Гайдуль К.В. Сравнительное исследование иммуноактивных и антибактериальных свойств нативного и механически модифицированного цефотаксима // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1. - С. 202-203.
  3. Душкин А.В. Возможности механохимической технологии органического синтеза и получения новых материалов // Химия в интересах устойчивого развития. - 2004. - Т.12, №3. - С. 251-274.
  4. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. - МУК 4.2.1890-04. - 91 с.
  5. Орлов Д.С. Действие комплексов природных антимикробных пептидов и наночастиц серебра на микроорганизмы // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т.9, № 2. - С. 32-36.
  6. Chamundeeswari M. Preparation, characterization and evaluation of a biopolymeric gold nanocomposite with antimicrobial activity // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2010. - Vol. 55. - P. 29-35.
  7. Dushkin A.V. Mechanochemical synthesis of organic compounds and rapidly soluble materials: in High-energy ball milling. - Mechanochemical processing of nanopowders. - Woodhead Publishing Limited. - Oxford, 2010. - P. 249-273.
  8. Rai A. Antibiotic mediated synthesis of gold nanoparticles with potent antimicrobial activity and their application in antimicrobial coatings. / A. Rai, A. Prabhune, C.C. Perry // J. Mater. Chem. - 2010. - Vol. 20. - P. 6789-6798.
  9. Seleem M. N. Silica-Antibiotic hybrid nanoparticles for targeting intracellular pathogens // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2009. - P. 4270-4274.
  10. Slowing I.I. Mesoporous silica nanoparticles as controlled release drug delivery and gene transfection carriers // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2008. - Vol. 60. - P. 1278-1288.

Рецензенты:

Смагин А.А., д.м.н., профессор, зав. лабораторией лимфодетоксикации НИИКЭЛ СО РАМН, г. Новосибирск;

Павлов В.В., д.м.н., ведущий научный сотрудник, зав. отделением эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов ФГУ «Новосибирский НИИТО» Росздравсоцразвития, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 20.05.2011.