В настоящее время бурное развитие горнодобывающей и рудоперерабатывающей промышленности привело к загрязнению окружающей среды. В процессе функционирования горнодобывающих предприятий происходит техногенное загрязнение почвы, воздуха и воды, что разрушительно влияет на природные сообщества, в том числе и микробные. Состояние почвенных микробных сообществ может служить индикатором благополучия почвенных экосистем. Существующие классические методы изучения микрофлоры почвы зачастую очень трудоемки и не всегда достоверны. Оценка реального фенотипического биоразнообразия микробных сообществ традиционными культуральными методами представляет проблему, так как в данном местообитании могут присутствовать какие-то некультивируемые или просто не растущие на данной среде формы. Общее биоразнообразие микробных сообществ включает в себя такие составляющие, как генотипическое и функциональное биоразнообразие. Оценку генотипического биоразнообразия можно проводить с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), однако ограниченность набора праймеров, дороговизна исследований не позволяет широко внедрить в практику этот метод. Функциональное биоразнообразие проявляется как разнообразие реализованной в данном местообитании функционально значимой генетической информации. Наиболее удобным и доступным инструментом измерения функционального биоразнообразия является метод мультисубстратного тестирования (МСТ) [1, 2].
В основе МСТ лежит анализ спектров потребления субстратов (СПС) природными микробными сообществами. По существу эта система представляет полную реализацию на современном уровне классической идеи С.Н. Виноградского о методе, позволяющем регистрировать реакцию сложного природного микробного сообщества на предлагаемый к использованию широкий спектр разнообразных углеродсодержащих соединений.
К достоинствам МСТ можно отнести высокую чувствительность при регистрации разнообразных изменений в микробном сообществе, что связано с исключительно богатой комбинаторикой сигналов. Регистрация и обработка данных осуществляются с помощью современных компьютерных технологий, что позволяет эффективно и быстро охарактеризовать структурно-функциональные особенности микробных сообществ.
Цель данной работы заключалась в изучении состояния микробных сообществ почв в окрестностях Сибайской обогатительной фабрики (СОФ), являющейся источником загрязнения (ИЗ) окружающей среды тяжелыми металлами, методом МСТ. Территория г. Сибай Республики Башкортостан расположена в зоне влияния крупного перерабатывающего предприятия - Сибайского филиала Учалинского горнообогатительного комбината (СФ УГОК), в состав которого входит ряд промышленных объектов, в том числе обогатительная фабрика и карьер по добыче медно-серной руды. Одним из источников загрязнения почвы ионами тяжелых металлов является хвостохранилище. Отсутствие водного слоя в западном отсеке хвостохранилища способствует выносу пылевых частиц, содержащих компоненты хвостов обогащения, на поверхность земли. В результате этого верхние горизонты почв в большей степени загрязнены тяжелыми металлами по сравнению с нижними горизонтами [3].
Нами были исследованы образцы верхнего горизонта почвы (0-20 см), отобранные на пробных площадках, расположенных на удалении 0,5 км (№1), 5 км (№2) и 15 км (№3) от ИЗ в восточном направлении по преобладающей розе ветров.
Для проведения МСТ использовали стандартные планшеты для иммунологических тестов, представляющие собой пластины из прозрачного пластика с 96 ячейками, содержащими 47 субстратов (сахара, спирты, соли органических кислот, аминокислоты, амины, амиды, нуклеозиды) в 2-х повторностях. Две ячейки были контрольными. Данные планшеты с субстратами были приготовлены на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова под руководством М.В. Горленко. В каждую ячейку был добавлен определенный субстрат, набор минеральных солей, тетразолий фиолетовый (как индикатор потребления субстрата) и 0,2 мл почвенной суспензии после ультразвуковой обработки и центрифугирования.
Микрокюветы инкубировали 72 часа при температуре 28 °С. При росте микроорганизмов в ячейках происходило восстановление неокрашенных солей тетразолия до бордово-окрашенного формазана, который накапливался в ячейках в виде гранул. Регистрацию окраски осуществляли с помощью многоканального фотометра (ридера) при 510 нм. Для окончательного выражения окрашенности ячейки использовали показатель
D = (C - R)/[(C - R)]/N,
где С - выраженная в показаниях прибора окраска данной ячейки; R - то же для контрольной ячейки; N - число субстратсодержащих ячеек [1].
Сравнение микробных сообществ почвенных образцов на базе трансформированных вышеуказанным образом данных проводили в системе STATISTICA.
Обработка результатов МСТ проводилась в несколько этапов - от простого к сложному. На начальной стадии оценивались количество используемых субстратов и интенсивность их потребления.
Анализ спектров ассимиляции субстратов различными почвенными суспензиями показал, что существуют четкие количественные и качественные различия в их потреблении, позволяющие говорить о наличии характерного спектра ассимиляции для почвенных образцов определенного типа. Так, микробные сообщества наиболее загрязненного почвенного образца №1, взятого на расстоянии 0,5 км от ИЗ, из 47 субстратов ассимилировали только 9 (арабинозу, глюкозу, цитрат, глицин, пролин, галактозу, гистидин, твин 80, фруктозу), в то время как для образца №3, расположенного в 15 км от ИЗ, это показатель был равен 19 (рисунок).
Почвенное микробное сообщество представляет собой сложную иерархическую систему, элементы которой определенным образом взаимоупорядочены в соответствии с ранговым распределением. Авторами метода МСТ была предложена трехпараметрическая модель рангового распределения потребления субстратов почвенным микробным сообществом почв [1]:
F(n) = E0 - bendn,
где n = ln(N), N - номер ранга; F(n) = ln(yN), yN - интенсивность потребления субстрата ранга N, е - основание натурального логарифма, Ео, b, d - параметры.
Согласно литературным данным [1], наиболее информативным является коэффициент d, отражающий стабильность сообщества. Стабильность - это способность экосистемы вернуться в прежнюю область устойчивого равновесия после временного воздействия какого-либо фактора. В зависимости от значения коэффициента d экосистема имеет разную степень изменения от благополучной с максимальным запасом прочности до необратимо нарушенной (таблица).
Зависимость характера системы от значения d [1]
|
Значение d |
Описание системы |
|
0,01-0,1 |
Благополучная избыточная система с максимальным запасом прочности |
|
0,1-0,4 |
Устойчивая стабильная система |
|
0,4-0,8 |
Система с истощенными ресурсами или система, находящаяся под обратимым воздействием какого-либо нарушающего фактора |
|
0,8-1,0 |
Кризисная дестабилизированная система |
|
Более 1,0 |
Необратимо нарушенная система |
Спектр ассимиляции субстратов микробными сообществами почв, находящихся на различном расстоянии от Сибайской обогатительной фабрики
Результаты нашего исследования свидетельствуют, что к необратимо нарушенным системам относятся почвенные микробные сообщества с участка №1 (0,5 км от ИЗ). В данном случае параметр d был равен 1,2. К устойчивым стабильным системам можно отнести микробные сообщества почв с участка №2 (5 км от ИЗ) с d, равном 0,2, а к благополучным избыточным системам с максимальным запасом прочности - сообщества с участка №3 (15 км от ИЗ) с d, равном 0,05.
Таким образом, можно заключить, что с приближением к источнику техногенного загрязнения состояние микробных сообществ почвенных экосистем ухудшается. В радиусе примерно 0,5 км от источника загрязнения микробные сообщества являются наиболее подверженными техногенному загрязнению.
Список литературы
- Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ: учебное пособие. - М.: МАКС Пресс, 2005. - 88 с.
- Горленко М.В., Кожевин П.А. Дифференциация почвенных микробных сообществ с помощью мультисубстратного тестирования // Микробиология. - 1994. - Т. 63, №2. - С. 289-293.
- Семенова И.Н., Ильбулова Г.Р., Суюндуков Я.Т. Влияние техногенного загрязнения на стабильность микробных сообществ почвенных горизонтов // Уралэкология. Природные ресурсы: тезисы докл. Всерос. конф. - Уфа, 2005. - С. 163-164.
Рецензенты:
Янтурин С.И., д.б.н., зав. кафедрой экологии Сибайского института (филиал) ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г. Сибай,
Мазгаров И.Р., д.б.н., зав. кафедрой физиологии человека и животных Сибайского института (филиал) ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г. Сибай.
Работа поступила в редакцию 15.02.2011.