В настоящее время есть достаточный набор технических средств для реализации трехмерной реконструкции геометрии клеток и тканевых структур с помощью конфокальной микроскопии [7 и др.] или использования серийных срезов фиксированного материала [5, 6]. В связи с этим изучение действия химических фиксаторов на морфологию клеток, в частности растительных клеток, приобретает важнейшее значение, т.к. без учета изменения морфологии клеток под действием фиксаторов можно получить искаженную объемную модель изучаемых клеток и ее структур. Обсуждение роли морфологических артефактов при 3-мерной реконструкции клеток животных с использованием серийных срезов приведено в специальном обзоре [2]. Изучение действия химических фиксаторов на морфологию клеток представляет одну из важнейших и старых проблем цитологии и цитохимии [3, 8, 9].
В данной работе, приведены результаты изучения динамики изменения некоторых морфометрических характеристик живых растительных клеток при действии спирт-формалинового фиксатора, широко используемого в растительной гистологии и гистохимии.
Материал и методы исследования
В работе использован лист Элодеи (Elodeae сanadensis Michx.). Мелкие верхушечные листочки целиком помещались в специальную проточную термостатированную микрокамеру объемом 50 мкм3 [4]. Все опыты проводились при температуре 20 ºС, состав спирт-формалинового фиксатора: этиловый спирт (96 %) и формалина (4 %, приготовлен из параформа), в соотношении 1:6. Проток растворов через микрокамеру осуществлялся перистальтическим микронасосом рр1-05, Польша, Zalimp), скорость протока 333 мкл/мин. Использовался инвертированный микроскоп Olympus IX 71, соединенный с 3-матричным видекамкордером HD GY101 (фирма JVC, Япония) и видеомонитором PWM-14M2E (Sony, Япония). Обработка видеофильмов осуществлялась программой Pinnacle Studio 9.0. Изображения отдельных кадров обрабатывались графическим редактором AdobePhotosop 7.0 (перевод в черно-белые 8-ми битовые изображения, фильтрация - усиление резкости границ). Измерение площадей проводилось при помощи программы PhotoM (http://t_lambda.chat.ru). Контур каждой клетки измерялся 5 раз и рассчитывалась средняя величина площади контура. Статистическая обработка результатов осуществлялась при помощи программы Statistica v.6.0. Всего было снято 8 видеофильмов, два из которых подвергнуты морфометрическому анализу.
Результаты исследования и их обсуждение
Эксперимент 1. Временная диаграмма эксперимента приведена на рис. 1.
После начала протока воды, через 15-20 мин, начинается интенсивное круговое движение крупных хлоропластов в клетках (на временной шкале опыта, рис. 1, это время не показано). Общий вид клеток листа в разные периоды видеосъемки представлен на рис. 2. Были выбраны 17 клеток верхнего слоя клеток листа элодеи, площадь которых измерялась в димнамике фиксации. Начальная площадь клеток была в пределах от 800 до 1440 мкм2 (табл. 1).
Рис. 1. Временная диаграмма эксперимента 1. Обозначения: В - проток воды; Ф - проток фиксатора; н+ и н- - насос включен (проток) или выключен (протока нет); с - периоды видеосъемки; к1 - к8 - кадры, взятые из видеофильма для морфометрического анализа, в скобках указаны времена соответствуюших кадров в общей шкале временной шкалы эксперимента
Рис. 2. Изменение морфологии клеток в динамике фиксации. Об.10х. Пластинки
(к.1 - к.4 - номера кадров, к.1, 4 - проток воды; к.2, 3 - действие фиксатора (см. рис. 1).
1-17 - номера клеток, площадь которых была измерена (табл. 1); к.5, 8 - проток воды;
к. 6, 7 - действие фиксатора
Хлоропласты эллипсоидной формы, скорость их кругового движения равна, в среднем, 2-3 мкм/с.
Таблица 1
Площади клеток листа Элодеи в динамике фиксации (рис. 2)
|
Номер клеток |
к1 Вода Н Начало опыта (100 %) M ± m |
к2 Фиксатор |
к 3 Фиксатор |
к 4 Вода |
|||
|
M ± m |
% |
M ± m |
% |
M ± m |
% |
||
|
1 |
1440,9 ± 19,3(4) |
1275,7 ± 57,6(4) |
88,5 |
1208,6 ± 18,8(6) |
83,9 |
1380,5 ± 8,5 (3) |
95,8* |
|
2 |
1192,3 ± 25,7(7) |
876,0 ± 12,8(3) |
73,5 |
868,8 ± 17,8(6) |
72,9 |
1107,4 ± 11,3(8) |
92,9 |
|
3 |
1103,8 ± 32,8(3) |
830,2 ± 31,9(3) |
75,2 |
820,9 ± 20,1(6) |
74,4 |
1046,0 ± 27,2(3) |
94,8* |
|
4 |
1502,7 ± 10,1(8) |
1252,9 ± 19,6(8) |
83,4 |
1330,1 ± 24,9(6) |
88,5 |
1463,2 ± 8,4(3) |
97,4* |
|
5 |
940,0 ± 28,9(3) |
854,5 ± 10,4(3) |
90,9 |
667,8 ± 14,2(6) |
71,0 |
923,6 ± 21,9(3) |
98,2* |
|
6 |
1127,1 ± 7,1 (8) |
964,0 ± 16,0(8) |
85,5 |
998,9 ± 57,5(6) |
88,6 |
990,0 ± 14,0(3) |
87,8 |
|
7 |
1042,8 ± 3,8 (8) |
887,7 ± 5,9 (8) |
85,1 |
881,4 ± 17,0(6) |
84,5 |
1002,9 ± 3,4 (3) |
96,2 |
|
8 |
965,6 ± 9,5 (8) |
734,8 ± 6,6 (8) |
76,1 |
826,2 ± 18,8(6) |
85,6 |
932,8 ± 7,9 (3) |
96,6* |
|
9 |
975,0 ± 9,2 (8) |
886,0 ± 9,8 (3) |
90,9 |
841,5 ± 14,4(6) |
86,3 |
941,4 ± 8,2 (8) |
96,6 |
|
10 |
882,6 ± 22,3(3) |
733,5 ± 15,0(3) |
83,1 |
720,8 ± 20,4(6) |
81,7 |
882,4 ± 22,3(3) |
99,9* |
|
11 |
1704,6 ± 40,7(4) |
1575,1 ± 29,9(4) |
92,4 |
1597,6 ± 18,1(6) |
93,7 |
1685,5 ± 25,9(3) |
98,9* |
|
12 |
1153,8 ± 3,5 (8) |
887,4 ± 5,5 (8) |
76,9 |
983,5 ± 12,0(6) |
85,2 |
1118,1 ± 22,5(3) |
96,9 |
|
13 |
1194,7 ± 4,5 (8) |
1026,4 ± 5,0 (8) |
85,9 |
1021,0 ± 11,2(6) |
85,5 |
1137,5 ± 11,46(8) |
95,2 |
|
14 |
1254,4 ± 36,6(4) |
1065,8 ± 55,1(4) |
85,0 |
1057,5 ± 25,7(6) |
84,3 |
1201,1 ± 5,4(3) |
95,7* |
|
15 |
904,6 ± 5,1 (8) |
727,0 ± 5,3 (8) |
80,4 |
845,6 ± 6,8 (6) |
93,5 |
855,7 ± 9,3 (8) |
94,6 |
|
16 |
990,4 ± 31,4(3) |
873,8 ± 11,4(3) |
88,2 |
792,3 ± 12,2(6) |
80,0 |
935,1 ± 22,9(3) |
94,4* |
|
17 |
1007,6 ± 21,5(4) |
898,4 ± 31,0(4) |
89,2 |
828,3 ± 25,7(6) |
82,2 |
900,0 ± 4,0 (3) |
89,3 |
Примечание: площадь клеток в мкм2; M ± m - среднее значение ± ошибка средней величины; t-критерий рассчитывался между значениями площади в к 1 и к 2-4. Для всех приведенных данных Р < 0,05, кроме отмеченных * - разница недостоверна. В скобках - число измерений. Эксперимент 1, кадры 1-2-3-4 (см. рис. 2).
Продолжение табл. 1
|
Номер кле-ток |
к 5 Переход от воды к фиксатору |
к 6 Фиксатор |
к 7 Фиксатор
|
к 8 Вода |
||||
|
M ± m |
% |
M ± m |
% |
M ± m |
% |
M ± m |
% |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
1 |
1263,9 ± 15,2(6) |
87,7 |
1114,6 ± 17,7(6) |
77,3 |
1179,5 ± 23,9(3) |
81,8 |
1393,8 ± 22,8(6)* |
96,7 |
|
2 |
984,7 ± 22,3(6) |
82,7 |
871,0 ± 25,4(6) |
73,0 |
868,4 ± 25,2(3) |
72,8 |
1065,2 ± 24,9(6) |
89,3 |
|
3 |
894,8 ± 21,4(6) |
81,1 |
766,6 ± 18,5(6) |
69,4 |
886,6 ± 23,8(3) |
80,3 |
936,5 ± 19,1(6) |
84,8 |
|
4 |
1306,5 ± 15,3(6) |
86,9 |
1319,5 ± 36,2(6) |
87,8 |
1372,2 ± 24,0(3) |
91,3 |
1402,7 ± 18,7(6) |
93,3 |
|
5 |
716,7 ± 25,6(6) |
76,2 |
655,9 ± 16,3(6) |
69,8 |
710,9 ± 25,16(3) |
75,6 |
789,4 ± 33,3(6) |
84,0 |
|
6 |
979,7 ± 46,0(6) |
86,9 |
997,8 ± 21,3(6) |
88,5 |
996,6 ± 30,6(3) |
88,4 |
1097,2 ± 15,1(6)* |
97,3 |
|
7 |
928,7 ± 22,1(6) |
89,1 |
767,1 ± 26,0(6) |
73,6 |
938,3 ± 18,2(3) |
90,0 |
968,8 ± 22,6(6) |
92,9 |
|
8 |
859,1 ± 21,8(6) |
89,0 |
810,0 ± 15,3(6) |
83,9 |
753,2 ± 43,2(3) |
78,0 |
877,8 ± 26,1(6) |
90,9 |
|
9 |
873,4 ± 18,4(6) |
89,6 |
828,1 ± 23,1(6) |
84,9 |
806,4 ± 24,1(3) |
82,7 |
914,5 ± 11,6(6) |
93,8 |
|
10 |
818,6 ± 11,7(6) |
92,8 |
719,5 ± 16,4(6) |
81,5 |
796,7 ± 53,8(3) |
90,3* |
857,7 ± 10,8(6)* |
97,2 |
|
11 |
1599,1 ± 20,7(6) |
93,8 |
1575,7 ± 21,3(6) |
92,4 |
1522,7 ± 52,6(3) |
89,3 |
1605,0 ± 23,7(6)* |
94,1 |
|
12 |
1048,8 ± 24,0(6) |
90,9 |
970,9 ± 15,3(6) |
84,1 |
990,7 ± 22,9(3) |
85,9 |
1036,4 ± 18,0(6) |
89,8 |
|
13 |
1105,6 ± 11,4(6) |
92,5 |
1105,9 ± 14,0(6) |
92,6 |
1076,6 ± 50,2(3) |
90,1 |
1076,7 ± 22,0(6) |
90,1 |
|
14 |
1150,0 ± 19,2(6) |
91,7 |
1097,5 ± 20,8(6) |
87,5 |
1242,8 ± 46,6(3) |
99,1* |
1076,5 ± 28,3(6) |
85,8 |
|
15 |
821,2 ± 16,8(6) |
90,8 |
813,6 ± 14,1(6) |
89,9 |
855,3 ± 25,7(3) |
94,5 |
883,5 ± 11,6(6)* |
97,7 |
|
16 |
887,8 ± 16,3(6) |
89,6 |
829,4 ± 26,0(6) |
83,7 |
887,6 ± 66,2(3) |
89,6* |
892,2 ± 12,2(6) |
90,1 |
|
17 |
839,1 ± 27,8(6) |
83,3 |
822,2 ± 28,9(6) |
81,6 |
829,3 ± 35,1(3) |
82,3 |
885,8 ± 20,1(6) |
87,9 |
Примечания: t-критерий рассчитывался между значениями площади в к1 и к5-8. Для всех приведенных данных Р < 0,05;
* - разница недостоверна. В скобках - число измерений.Эксперимент 1, кадры 5-6-7-8 (см. рис. 1).
В первые секунды действия фиксатора во всех клетках наблюдается полная остановка движения хлоропластов, затем происходит усиление зеленого фона, что связано с разрушением хлоропластов и выходом хлорофилла в проточный раствор. При включении протока воды происходит постепенное восстановление площади клеток к исходному состоянию (рис. 2, к.4,5,8). Однако остановка движения и уменьшенное число хлоропластов в клетках необратимо. В конце опыта кратковременное включение протока фиксатора практически не изменяло картины (рис. 2, к.6,7).
Эксперимент 2. Временная диаграмма эксперимента приведена на рис. 3
Рис. 3. Временная диаграмма эксперимента 2. Обозначения см. рис. 1
Для видеосъемки была выбрана клетка площадью около 400 мкм2 для того, чтобы она полностью помещалась в поле зрения микроскопа при увеличении объектива 40×0,4.
В первые секунды контакта фиксатора с клетками листа хорошо видно, что происходит сморщивание хлоропластов, цитоплазма клеток приобретает мелкоскладчатый характер, с появлением многочисленных ячеистых структур. Клеточные стенки слегка утолщаются, становятся «лохматыми». В конце опыта внешний вид клеток приближается к норме, хотя видно сильное уменьшение количества хлоропластов и остаточные в цитоплазме и клеточной стенке.
Заключение
Таким образом, можно резюмировать, что при действии на клетки спирт-формалинового фиксатора площадь клеток листа Элодеи уменьшается до 75-90 % от исходной площади в контроле. После промывки площадь клеток листа элодеи постепенно возвращается к норме, но не достигает контрольного уровня. Другими словами, в клеточной стенке сохраняется остаточная деформация, вызванная фиксатором. В классических работах Байкера показано, что спирт и формалин приводят к уменьшению объемов модельных систем (альбумин-желатиновые блоки) [3]. Cкорость проникновения формалина в клетки тычиночных волосков томатов равна 120 мкм/мин [9], добавление этанола практически не влияет на скорость проникновения в эти же клетки (данные для фиксатора Карнуа). Учитывая, что толщина листа элодеи равна в пределах 60-100 мкм, можно считать, что в наших опытах фиксация должна быть полной.
Таблица 2
Площади клетки (мкм2) в норме и после действия фиксатора
|
№ к.* |
I Вода (1) |
№ к. |
II Фиксатор (1) |
№ к. |
III Вода (2) |
№ к. |
IV Фиксатор (2) |
№ к. |
V Вода (3) |
|
1 |
427,2 ± 4,3** |
9 |
334,9 ± 5,6 |
17 |
420,0 ± 3,4 |
25 |
367,7 ± 3,1 |
33 |
423,4 ± 5,4 |
|
2 |
447,6 ± 2,5 |
10 |
387,7 ± 3,6 |
18 |
416,3 ± 7,8 |
26 |
367,2 ± 3,7 |
34 |
433,9 ± 3,8 |
|
3 |
436,8 ± 3,3 |
11 |
372,7 ± 4,5 |
19 |
457,2 ± 4,2 |
27 |
344,3 ± 4,8 |
35 |
414,8 ± 1,8 |
|
4 |
457,4 ± 3,4 |
12 |
355,5 ± 4,1 |
20 |
435,5 ± 4,3 |
28 |
355,1 ± 3,1 |
36 |
437,7 ± 3,0 |
|
5 |
459,1 ± 3,8 |
13 |
348,0 ± 5,9 |
21 |
444,7 ± 4,3 |
29 |
360,0 ± 5,1 |
37 |
431,2 ± 2,5 |
|
6 |
455,8 ± 6,5 |
14 |
340,3 ± 4,8 |
22 |
461,8 ± 5,0 |
30 |
361,2 ± 3,8 |
38 |
458,8 ± 5,9 |
|
7 |
460,4 ± 3,0 |
15 |
351,8 ± 2,1 |
23 |
409,4 ± 2,7 |
31 |
351,6 ± 3,9 |
39 |
438,6 ± 7,0 |
|
8 |
444,2 ± 7,4 |
16 |
355,9 ± 3,8 |
24 |
412,3 ± 3,5 |
32 |
369,6 ± 5,4 |
40 |
442,7 ± 5,2 |
|
448,5 ± 2,3+ (100 %) |
355,8 ± 2,9 (79,3 %) |
432,2 ± 3,4 (96,3 %) |
359,6 ± 3,1 (80,2 %) |
435,1 ± 2,5 (97,0 %) |
Примечание: * - номера кадров из видеофильма (см. рис. 3); ** - М ± m (5 измерений); Разница достоверна по t-критерию: между I - II и I - IV (P < 0,001); + - М ± m (среднее значение площади, суммированное по 8 кадрам - 40 измерений).
При изучении действия разных фиксаторов на живые растительные клетки (черешковые волоски Lусopersicum esсulentum), в частности показано, что этанол вызывал интенсивное вспенивание цитоплазмы, в то время как движение протоплазмы продолжалось. Другие фиксаторы, такие как альдегиды, содержащие ионы кальция, приводили сразу к остановке движения цитоплазмы и везикуляции канальцевой системы [8]. В обзоре Р.Барера приводятся данные о том, что действие фиксаторов приводит к серьезным изменениям структуры живых клеток («мягкие» фиксаторы, такие как формальдегид в меньшей степени, а такие как пикриновая кислота или сулема приводят к появлению серьезных морфологических артефактов [1]. В ряде работ, проведенных в первой половине прошлого столетия, делалась попытка развить традиционные методы изучения фиксации живых клеток (см., например, ссылки [1, 3]). Эти работы ясно показали, «...ценность такого подхода и для выбора наилучшего фиксатора, и для интерпретации картин фиксированных клеток. Удивительно, однако, этот интенсивный поиск более лучших фиксаторов, развитие электронной микроскопии не возродили интерес к этому направлению...» [8]. С сожалением можно констатировать, что эти слова не потеряли актуальность и в наше время.
Дополнительные материалы к данной статье изложены в http://cam.psn.ru. Работа выполнена на средства гранта РФФИ № 07-04-00510.
Список литературы
- Барер Р. Фазово-контрастная, интерференционно-контрастная и поляризационная микроскопия // Методы цитологичекого анализа; под ред. А.Л. Шабадаш.- М.: ИИЛ, 1957.- С. 107-178.
- Буданцев А.Ю., Айвазян А.Р. Компьютерная 3-х мерная реконструкция биологических объектов с использованием серийных срезов // Морфология.- 2005. - Т. 127, №1.- С. 72-78.
- Bаker J.R. Principlеs of Biological Microtechnique. - London: Methuеn, 1958.- Р. 19-155.
- Budantsev A.Yu. Microchambers for inverted microscopes // Biotechnic and Histochemistry. - 2007. - Vol. 82, № 4-5. - Р. 263-266.
- Budantsev A.Yu., Jakovlev Y.Y. 3-D Reconstruction of Biological Objects. The potencial of standard computer programs // Microscopy and Analysis. - 2000. - Vol. 67. - Р. 29-31.
- Fiala J.C. Reconstruct a free editor for serial section microscopy // Journal of Microscopy. - 2005. - Vol. 218, Pt. - Р. 52-61.
- Gray, J.D., Kolesik, P., Hoj, P.B., Coombe, B.G. Confocal measurement of the three-dimensional size and shape of plant parenchyma cells in a developing fruit tissue // The Plant Journal. - 1999. - Vol. 19. - Р. 229-236.
- Mersey B., МсCully М.Е. Monitoring of thе сoursе of fixation of plant сеlls // Journal of Microscopу. - 1978. - Vol. 114, Pt.1. - Р. 49-76.
- O´Brien T.P., McCully M.E. The study of plant structure principles and selected methods. - Melbourne: Blackwell Sci.Publ. - 1981. - Р. 4.19-4.36.
Рецензенты:
Новоселов В.И., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник Института биофизики клетки РАН, г. Пущино;
Асланиди К.Б., д.ф.-м.н., ведущий научный сотрудник Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.
Работа поступила в редакцию 11.04.2011.