При ревматических заболеваниях создаются условия для длительной микробной персистенции в результате особенностей формирования иммунного ответа хозяина, в частности, дисбаланса Th1 и Th2-клеток в динамике развития заболевания [8]. Наряду с этим, длительное переживание (персистенция) микроорганизмов в организме больных может быть обусловлено свойствами микроорганизмов. В персистировании микроорганизмов имеет значение их индифферентность к воздействующим внешним факторам физико-химической природы, обеспечение стабильных антагонистических эффектов в биоценозе и сохранением жизнеспособности популяции за счёт приобретения устойчивости к защитным механизмам хозяина [2]. Бактерии способны ингибировать факторы естественной резистентности организма хозяина, такие как лизоцим, комплемент, гистоноподобные белки, катионный белок тромбоцитов. Этот дистанционный механизм бактериальной иммуносупрессии хозяина способствует длительному выживанию (персистированию) патогенных и условно-патогенных бактерий в макроорганизме [1].
Цель: изучение персистентного потенциала условно-патогенных микроорганизмов, выделенных у больных ревматическими заболеваниями, на основании исследования их антилактоферриновой и антилизоцимной активности.
Материалы и методы исследования
Изучено 157 штаммов условно-патогенных микроорганизмов, из них 83 штамма, выделенных от больных ревматическими заболеваниями, и 74 клинических штамма, полученных у лиц группы сравнения. Исследованные штаммы получены при бактериологическом обследовании 97 больных ревматическими заболеваниями, из них 59 - ревматоидным артритом и 38 больных системной красной волчанкой. Диагноз ревматоидного артрита устанавливали согласно критериям Американской ревматологической ассоциации (1987). Преобладали пациенты с I-II рентгенологической стадией (71 %) и у 29 % больных определялась III рентгенологическая стадия поражения суставов. Большинство пациентов (84,7 %) имели II степень функциональной недостаточности суставов. Для оценки активности болезни использовали индекс активности болезни - DAS4 (disease activity score). I степень активности РА установлена у 30,5 %, II - у 50,8 % и III - у 18,6 % больных. Серопозитивная форма РА установлена у 86,4 % больных, у остальных - серонегативная. Диагноз системной красной волчанки устанавливали согласно критериям Американской ревматологической ассоциации (1982). Степень активности заболевания определяли, используя индекс ECLAM. Обследованы больные I (47,4 %) и II (52,6 % больных) степени активности, с подострым (57,9 %) и хроническим (42,1 % больных) течением. Больные обследованы бактериологическим методом, руководствуясь приказом МЗ №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» (2006). Исследуемым материалом служили моча и отделяемое со слизистых оболочек носа. Идентификацию выделенных культур проводили по морфологическим, тинкториальным, культуральным и ферментативным свойствам согласно руководству по систематике бактерий Берги. Выделенные при ревматических заболеваниях штаммы условно-патогенных микроорганизмов были отнесены к видам стафилококка (Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis) и бактериям семейства Enterobacteriaceae родов Escherichia, Klebsiella. В качестве группы сравнения были использованы клинические штаммы идентичных по видовой и родовой принадлежности микроорганизмам, полученным у ревматических больных. Клинические штаммы выделены при бактериологическом исследовании материала со слизистой оболочки носа у больных ринитом и из мочи при бактериурии.
Изучение антилактоферриновой активности микроорганизмов (АЛФА) проводилось методом, основанным на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) [4]. Антилактоферриновую активность выражали в абсолютных величинах (нг/мл) инактивированного микроорганизмами лактоферрина. Антилизоцимную активность микроорганизмов (АЛА) определяли фотометрическим методом [5]. Антилизоцимную активность микроорганизмов выражали в мкг/мл, оценивая остаточную активность фермента после инкубации супернатанта исследуемой культуры и раствора лизоцима в отношении тест-культуры Micrococcus lyteus. Статистический анализ данных выполнен на IBM PC совместимом компьютере с помощью программы STATISTICA (Data analysis software system, StatSoft) версия 7.0. Результаты исследований представлены в виде средней ± стандартное отклонение (М ± SD). Сравнение непрерывных величин с нормальным распределением проводилось с помощью t-критерия Стъюдента. Дискретные величины сравнивались с использованием критерия χ2. Различия между группами считались статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенные исследования показали широкое распространение факторов персистенции (антилактоферриновой и антилизоцимной активности) у микроорганизмов, выделенных у больных ревматическими заболеваниями (табл. 1).
Антилактоферриновый признак стафилококки имели в 63,16 - 100 % случаев. АЛФА выявлялась у 100 % культур S. aureus и S. haemolyticus, изолированных у лиц группы сравнения. У больных ревматическими заболеваниями штаммы стафилококков имели АЛФА в несколько меньшем проценте случаев, однако эти различия не носили существенного характера. Штаммы E. coli проявляли АЛФА в 100 % случаев, а бактерии рода Klebsiella имели данный признак в 78,57 % случаев у больных ревматическими заболеваниями и в 100 % случаев у лиц группы сравнения. Эти различия также не носили существенного характера (p > 0,05).
Антилизоцимная активность определялась у 100 % штаммов S. aureus. Штаммы S. epidermidis, выделенные у больных ревматическими заболеваниями, также имели АЛА в 100 % случаев, и только 50 % культур, изолированные у лиц группы сравнения, имели этот признак, что существенно меньше, чем у культур, полученных у больных (р < 0,05). Штаммы E. coli, полученные у больных, также отличались существенно большей частотой АЛА. АЛА культур бактерий рода Klebsiella выявлялась с высокой частотой от 71,43 до 100 %.
Таблица 1
Распространение антилактоферриновой
и антилизоцимной активности у штаммов микроорганизмов, выделенных у больных ревматическими заболеваниями
|
Микроорганизмы |
n |
Количество штаммов |
|||
|
с АЛФА |
с АЛА |
||||
|
абс. |
% |
абс. |
% |
||
|
S. aureus |
19 16 |
15 16 |
78,95 100 |
19 16 |
100 100 |
|
S. haemolyticus |
19 16 |
15 16 |
78,95 100 |
18 14 |
94,74 87,50 |
|
S. epidermidis |
19 16 |
12 15 |
63,16 93,75 |
19 8 |
100* 50 |
|
E. coli |
12 12 |
12 12 |
100 100 |
12 8 |
100* 66,67 |
|
Klebsiella spp. |
14 14 |
11 14 |
78,57 100 |
14 10 |
100 71,43 |
Примечание: числитель - микроорганизмы, выделенные у больных РЗ; знаменатель - клинические штаммы микроорганизмов группы сравнения; * - статистически достоверные различия, p < 0,05.
При определении выраженности маркёров персистенции установлена различная величина проявления антилактоферриновой и антилизоцимной защиты изученных культур условно-патогенных микроорганизмов (табл. 2).
Штаммы S. аureus, выделенные у больных ревматическими заболеваниями, имели АЛФА в пределах 20,08 ± 1,41 нг/мл и существенно не отличались по активности данного фактора от штаммов, полученных у лиц группы сравнения. Культуры S. haemolyticus, выделенные при ревматических заболеваниях, имели значительно меньшую АЛФА в пределах 11,50 ± 1,45 нг/мл, чем культуры, изолированные у лиц группы сравнения. Штаммы S. epidermidis и E. coli., выделенные у больных ревматическими заболеваниями, характеризовались существенно большей АЛФА, чем культуры данных микроорганизмов, полученные у лиц группы сравнения.
Выделенные у больных штаммы S. аureus характеризовались существенно более выраженной антилизоцимной активностью, равной 10,10 ± 2,17 мкг/мл, а у культур, выделенных у лиц группы сравнения, этот показатель был равен 4,40 ± 1,12 мкг/мл (р < 0,05). Величина АЛА S. haemolyticus и S. epidermidis, выделенных у больных, была значительно больше, чем у культур, полученных у лиц группы сравнения. Более значительным антилизоцимным потенциалом отличались бактерии семейства Enterobacteriaceae, полученные у больных ревматическими заболеваниями. Штаммы E. coli и Klebsiella spp. имели достоверно большие значения АЛА (р < 0,05).
Таблица 2
Антилактоферриновая и антилизоцимная активность микроорганизмов,
выделенных у больных ревматическими заболеваниями
|
Микроорганизмы |
n |
Антилактоферриновая активность, нг/мл |
Антилизоцимная активность, мкг/мл |
|
M ± SD |
|||
|
S. aureus |
15 16 |
22,72 ± 1,88 20,08 ± 1,41 |
10,1 ± 2,17* 4,40 ± 1,12 |
|
S. haemolyticus |
15 16 |
11,50 ± 1,45* 22,84 ± 1,41 |
9,91 ± 0,82* 4,19 ± 0,61 |
|
S. epidermidis |
12 15 |
7,83 ± 1,13* 5,65 ± 0,62 |
8,92 ± 2,45* 1,24 ± 0,25 |
|
E. coli |
12 12 |
23,87 ± 0,67* 18,17 ± 3,20 |
2,58 ± 0,27* 1,64 ± 0,15 |
|
Klebsiella spp. |
12 14 |
19,40 ± 2,47 18,13 ± 0,64 |
3,24 ± 0,27* 1,83 ± 0,28 |
Примечание: числитель - микроорганизмы, выделенные у больных РЗ; знаменатель - клинические штаммы микроорганизмов группы сравнения; * - статистически достоверные различия, p < 0,05.
Таким образом, при ревматических заболеваниях выделяются микроорганизмы, отличающиеся выраженным персистентным потенциалом. Отдельные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, полученные при ревматических заболеваниях, имеют более выраженные персистентные характеристики по сравнению с клиническими штаммами, выделенными при воспалительных процессах на слизистых оболочках носа и мочевыводящих путей. У больных ревматическими заболеваниями слизистые оболочки колонизированы стафилококками и бактериями семейства Enterobacteriaceae, чаще проявляющими антилизоцимную активность. Эпидермальные стафилококки и кишечная палочка, заселяющие организм больных ревматическими заболеваниями, имеют более выраженный антилактоферриновый потенциал, что может играть роль в патогенезе заболевания, снижая уровень лактоферрина и нарушая выживание нейтрофилов [6]. Наряду с этим, все штаммы отдельных видов стафилококков и кишечных бактерий проявляют существенно большую антилизоцимную активность. Высокий уровень антилизоцимной и антилактоферриновой защиты у микроорганизмов, выделенных при ревматических заболеваниях, может способствовать колонизации организма больных условно-патогенными бактериями. Колонизация условно-патогенными микроорганизмами слизистых может в свою очередь сопровождаться развитием ревматических заболеваний [7]. Наличие факторов персистенции у бактерий, заселяющих организм больного, также может способствовать развитию длительных воспалительных коморбидных инфекций при ревматических заболеваниях [3].
Выводы
1. При ревматических заболеваниях существенно чаще выделяются условно-патогенные микроорганизмы, имеющие антилизоцимную активность, при этом их антилактоферриновая активность обнаруживается с такой же частотой, как и у возбудителей воспалительных процессов слизистых оболочек носа и мочевыводящих путей.
2. Микроорганизмы, выделенные у больных ревматическими заболеваниями, отличаются большей антилизоцимной активностью, а эпидермальный стафилококк и кишечная палочка имеют высокую антилактоферриновую защиту.
Список литературы
- Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика // Журн. микробиол. - 2000 - № 4 - С. 4-7.
- Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова [и др.]. - М.: Медицина, 2005. - 367 с.
- Мустафаев М.Ш. Факторы персистенции микроорганизмов, выделенных при гнойно-воспалительных осложнениях переломов челюстных костей / М.Ш. Мустафаев, Ш.С. Кудаев, З.Ф. Хараева // Фундаментальные исследования. - 2005. - № 5 - С. 78-79.
- Новый метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов. / И.В. Валышева, А.В. Валышев, О.А. Карташова [и др.] // Журн. микробиол. - 2003 - № 4 - С. 64-67.
- Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, А.В. Валышев, Н.Н. Елагина [и др.] // Журн. микробиол. - 1997 - № 4 - С. 117-120.
- Lactoferrin is a survival factor for neutrophils in rheumatoid synovial fluid / S.H. Wong, N. Francis, H. Chahal [et al.] // Rheumatology (Oxford). - 2009. - №48(1) - P. 39-44.
- Sarjomaa M. From tonsillitis to coxitis / M. Sarjomaa, R.V. Liyanarachi, H. Brekke // Tidsskr. Nor. Laegeforen. - 2009. - № 129 (17). - Р. 1754-1755.
- Spellberg B. Type1/type2 immunity in infections diseases / B. Spellberg, J.E. Edwards // Clin.Infect. Dis. - 2001. - № 32. - Р. 76-102.
Рецензенты:
Раков А.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», г. Ярославль;
Шорманов С.В., д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Росздрава», г. Ярославль.
Работа поступила в редакцию 22.03.2011.