Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В патогенезе развития дисбактериоза кишечника важную роль играют не только количественные и качественные изменения микрофлоры, но и «патогенный потенциал» микроорганизмов [3]. Патогенность микроорганизма является полидетерминантным признаком, который определяется совокупным действием различных факторов патогенности, присущих возбудителю.

Условно-патогенные энтеробактерии рода Kiebsiella в последние годы привлекают внимание исследователей, так как, обладая выраженной биологической и экологической пластичностью, они могут приобретать возможность к длительному существованию в организме человека и являться причиной дисбиоза [7, 8, 9, 10]. В качестве одного из оснований этого явления рассматривают изменение патогенности этих микроорганизмов [2]. Установлено, что изменение патогенности у бактерий реализуется на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации [11]. Наиболее существенными для изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий, ввиду «скачкообразного» характера и кардинальности происходящих превращений микроорганизма, рассматривают генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность Enterobacteriaceae, реализуемую через несколько конкретных механизмов, связанных, в частности, с «островами» и «островками» патогенности [2].

До настоящего времени не изученными в инфекционной патологии остаются проблемы определения роли протозойно-бактериальных ассоциаций, в частности энтеробактерий рода Kiebsiella и простейших Blastocystis hominis, в патогенезе смешанных инфекций и развитии бактериальных осложнений.

Изменение важных характеристик вирулентности микроорганизмов-участников симбиотических ассоциаций, наряду с их количественной оценкой, может существенно сказаться на течении заболеваний, осложнённых дисбиозом кишечника [1, 5].

Цель исследования. В связи с этим целью настоящего исследования явилось определение генов Klebsiella pneumoniaе, кодирующих факторы патогенности, при дисбиотических нарушениях на фоне бластоцистной инвазии.

Материалы и методы исследования

Для изучении факторов патогенности мы использовали 119 штаммов K. pneumoniaе, выделенных у обследованных при патологиях желудочно-кишечного тракта на фоне бластоцистной инвазии. Группа сравнения включала 52 практически здоровых человека, репрезентативных по полу и возрасту.

Изучение микрофлоры кишечника у больных и лиц контрольной группы проводили согласно приказу Минздрава России от 09.06.2003 г. № 231 «Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003). Наличие бластоцист выявляли путем микроскопии нативных или окрашенных препаратов, приготовленных из фекалий больных. Культивирование простейших B. hominis проводили с использованием среды Suresh CEM [6, 12]. Вирулентность бластоцист определяли путём внутрибрюшинного введения белым мышам (массой 23,1 ± 2,2 г) 0,5 мл взвеси культуры простейших, выращенной на среде K.Suresh. Через сутки у каждого штамма определяли величину LD₅₀. В соответствии с получаемыми показателями к высоко вирулентным относили штаммы с LD₅₀ от 10¹ до 10³ КОЕ/мл, к умеренно вирулентным - от 10³ до 10⁶ КОЕ/мл, а штаммы с LD₅₀ свыше 10⁶ КОЕ/мл считали слабовирулентными (Костюкова и др., 1996).

Тотальную бактериальную ДНК выделяли из суточной агаровой культуры, 1 мл суспензии клеток осаждали при 12000 об./мин на центрифуге. Осадок ресуспендировали и разводили в буфере, содержащем 50 мМ KCl, 10 мМ трис-НСl (рН 8,4), 2,5 мМ MgCl₂, 0,01 % желатин, до конечной концентрации 10⁸ КОЕ/мл. Лизирование осуществляли лизоцимом (Германия) в концентрации 1 мг/мл в течение 15 мин при комнатной температуре (22-25 °С) с последующим добавлением протеиназы К до конечной концентрции 200 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин при 60 °С. Для обнаружения генов, кодирующих факторы патогенности клебсиелл, использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для этого применяли наборы НПФ «Литех», г. Москва. Хранение образцов перед использованием осуществляли при 4 °С.

Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ «Lasergene» (США). Используемые праймеры: PAP С1 (f) - 5̓-GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG-3̓̓̓ (65°C); hly A1(f)-5̓-GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG-3̓̓ (57 °C); LT1(f)-5̓-ATTTACGGCGTTACTATCCTC-3̓ (50 °C).

Результаты исследования и их обсуждение

Из выделенных 190 штаммов K. pneumoniaе 119 (77,8 %) получены у гастроэнтерологических больных с бластоцистной инвазией (1-я группа) и 71 (78,9 %) - у пациентов с таким же спектром заболеваний, но без бластоцитоза (2-я группа).

Используя набор праймеров, амплифицирующих фрагменты генов pap С (адгезины - пили Р), hly A (α-гемолизин), elt LT-1, LT-2 (термалабильные энтеротоксины), были протестированы фенотипически различные K. pneumoniaе: 119 штаммов, выделенный у гастроэнтерологических больных с бластоцистной инвазией, и 71 изолят - выделенных из консорциумов, где бластоцисты не являлись участниками микробного сообщества.

Выявление ампликонов проводили у клебсиелл, выделенных из ассоциаций с B. hominis различной степени вирулентности, а также после их совместного культивирования. В качестве контрольного использовали эталонный штамм К. pneumoniae, содержащий гены, детерминирующие синтез факторов патогенности.

Культуры бактерий при сокультивировании с простейшими отбирались в период увеличения их численности и проявления цитопатогенного действия на клетки бластоцист.

Для детекции генов, кодирующих определенные факторы патогенности, были протестированы штаммы с праймерами к pap С гену. Положительный сигнал был получен в первой группе клебсиелл с 31 культурой, что составило 26,1 %. В общем пуле штаммов, изолированных от больных второй группы, положительные сигналы были получены у 2 культур (2,8 %).

Анализ уровня распространенности ампликонов pap С генов после проведенного сокультивирования представлен в табл. 1 штаммов.

Таблица 1

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей pap С гена у культур K. pneumoniae

Примечание: * - показатель достоверности между показателями частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей pap С гена у культур K. pneumonia до и после их сокультивирования с бластоцистами (р < 0,05).

K. pneumoniae с бластоцистами различной степени вирулентности показал, что частота встречаемости фрагмента pap С гена клебсиелл была наиболее высокой после 3-х суток сокультивирования в ассоциации с высоковирулентными бластоцистами (21,8 ± 2,5 %).

Наиболее значимые различия в частоте обнаружения hly A генов имелись у клебсиелл, выделенных совместно с вирулентными бластоцистами после их совместного культивирования (рисунок).

Электрофореграмма рестрикционных профилей hly A гена у культур клебсиелл

Электрофореграмма рестрикционных профилей hly A гена у культур клебсиелл

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей hly A гена была практически одинаковой в первой и второй группах клебсиелл (табл. 2).

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей hly A гена у культур K. pneumoniae

Примечание: * - показатель достоверности между показателями частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей hly A гена у культур K. pneumoniaе до и после их сокультивирования с бластоцистами (р < 0,05).

Энтеротоксины (LT) являются основными факторами патогенности клебсиелл. Их образование кодируют хромосомные гены, они проявляют цитотоксичность в отношении клеток различных типов, вызывая приток жидкости в подслизистую оболочку кишечника [4].

Далее в собственных исследованиях изучали распространение генетических детерминант термалабильных энтеротоксинов (elt LT-1, LT-2) у клебсиелл, выделенных у гастроэнтерологических больных.

Из общего числа бактерий при инкубации с авирулентными бластоцистами ампликоны к elt LT-1, LT-2 были выявлены у 2,8 ± 0,4 % и 2,5 ± 0,3 % штаммов клебсиелл (табл. 3).

Таблица 3

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей elt LT-1, LT-2 генов культур K. pneumoniae

Примечание: * - показатель достоверности между показателями частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей elt LT-1 и LT- генов K. pneumoniaе до и после их сокультивирования с бластоцистами (р < 0,05).

Частота обнаружения ампликонов, специфичных изучаемым генам после проведения совместного культивирования клебсиелл с умеренно вирулентными бластоцистами, увеличилась в 2,1 и 2,0 раза, с высоковирулентными бластоцистами - 1,5 и 2,7 раза соответственно.

Вывод

Штаммы клебсиелл, выделенные из испражнений гастроэнтерологических больных с бластоцистной инвазией, обладали факторами, способствующими адгезии микроорганизма на поверхности кишечного эпителия и обеспечивающими устойчивость к защитным реакциям макроорганизма и персистенцию клебсиелл в кишечнике у лиц с дисбиотическими нарушениями. В общем пуле исследуемых штаммов клебсиелл отмечено увеличение частоты образования искомых ампликонов, специфичных изучаемым генам, усиливающееся в ассоциации с бластоцистами. В работе установлено статистически достоверное увеличение встречаемости изучаемых генов papС, hly A, elt LT-1, LT-2, индуцированное усилением вирулентности симбионтов B. hominis.

Полученные данные свидетельствуют об изменении патогенного потенциала бактерий под воздействием ассоциантов бластоцист, приводящих к селекции и накоплению вирулентных вариантов в гетерогенной бактериальной популяции, как механизма взаимодействия и выживания в системе «хищник-жертва».

Список литературы

1. Аклан Набила Ш.М. Распространенность и биологические свойства клебсиелл в условиях техногенной нагрузки крупного промышленного города: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Волгоград, 2006. - 23 с.
2. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий // Микробиология. - 2001. - №4. - С. 67-74.
3. Мамбетова Э.Ф. Сравнительная характеристика некоторых биологических свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Serratia и Staphylococcus aureus: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Челябинск, 2007. - 21 с.
4. Поздеев, О.К., Федоров, Р.В. Энтеробактерии: руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - С. 322-349.
5. Постникова Е.А. Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника у клинически здоровых детей в раннем возрасте // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - №1. - С. 62-67.
6. Простейшие Blastocystis hominis и их воздействие на макроорганизм / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.В. Бугеро, Н.А. Ильиа и др. - СПб.: Наука, 2009. - С. 25-30.
7. Титов Л.П., Шабан Ж.Г., Картель А.И. Использование продигиозана и тактивина в лечении больных хроническими клебсиеллезами // Журн. Микробиология. - 2001. - №5. - С. 46-49.
8. Фиалкина С.В. Обнаружение маркеров островов патогенности, известных для уропатогенных эшерихий, у клинических штаммов клебсиелл // Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2002. - Т.3. - С. 357-358.
9. Maroncle N., Balestrino D., Rich С. et.al. Identification of Klebsiella pneumoniae Genes Involved in Intestinal Colonization and Adhesion Using Signature-Tagged Mutagenesis / N. Maroncle, D. Balestrino, С.Rich et.al. // Infect Immun. - 2002. - Vol. 70 (8). - Р. 4729-4734.
10. Niyogi S.K., Pal A, Mitra U. et. al. Enteroaggregative Klebsiella pneumoniae in association with childhood diarrhea // Indian J Med Res. - 2000. - Vol. 112. - Р. 133-134.
11. See, K., Asher, D.M. / Multiplex PCR for detection of Enterobacteriaceae in blood // Transfusion. - 2001. - Vol. 41, №1. - P. 1356-64.
12. Tubulovesicular elements in Blastocystis hominis from the caecum of experimentally-infected rats / K. Suresh, S.Y. Chong, J. Howe, L.C. Ho, G.С. Ng, E.H. Yap, M. Singh // International Journal for Parasitology. - 1995. - Vol. 25. - P. 123-126.

Рецензенты:

Нестеров А.С., д.м.н., профессор кафедры инфекционных и кожно-венерических болезней ИМЭиФК Ульяновского государственного университета, г. Ульяновск;

Ильина Н.А., д.б.н., проректор по научной работе, профессор кафедры зоологии Ульяновского государственного университета имени И.Н. Ульянова, г. Ульяновск.

Работа поступила в редакцию 28.04.2011.