Заболевания печени представляют собой актуальную проблему современного здравоохранения в России и в мире в целом [3, 5, 7, 10]. В структуре данных заболеваний наибольшую распространенность получили гепатиты вирусной этиологии и алкогольное поражение печени, причем наблюдается увеличение тяжелых форм течения гепатитов с высоким риском формирования хронического поражения печени [7, 10].
Возникновение и характер патологического процесса в печени определяются его этиологией, но объединены одним общим механизмом повреждения - активацией процессов липопероксидации (ЛПО) [3-5, 7, 10]. Известно, что процессы ЛПО непрерывно протекают во всех органах и тканях в физиологических условиях и имеют важное метаболическое значение [3, 4, 10]. Контролируя уровень ЛПО, можно корригировать не только течение заболевания, но и функциональное состояние всего организма. Несмотря на успехи, достигнутые в изучении процессов ЛПО, данную проблему нельзя отнести к разряду окончательно разрешенных [3]. Несмотря на наличие большого количества методов и способов лечения патологии печени, ведутся активный поиск и разработка современных и экономичных методов, направленных на устранение токсического действия избытка продуктов липопероксидации [3, 4, 10]. Одним из перспективных путей в решении данной проблемы является разработка и внедрение в комплексное лечение заболеваний печени методов озонотерапии [2, 6, 9].
Цель исследования: оценить динамику показателей активности процессов липопероксидации при введении озона в условиях острой и хронической интоксикации тетрахлорметаном в эксперименте.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования проведены на 108 белых линейных крысах-самцах линии Вистар (масса тела 180-210 г.). Для получения озоно-кислородной смеси использовались озонаторы «Озон -
М-50» и «Озон - М-100» (ВГУ, Киров). Озонированный физиологический раствор (ОФР) получали путем барботажа озоно-кислородной смесью (концентрация озона 1, 10 и 100 мкг/кг) в течение 15 минут. Концентрацию озона в растворе контролировали методом йодометрического титрования и спектрофотометрически (СФ-46; длина волны 254,5 нм). ОФР вводили лабораторным животным внутрибрюшинно в течение 10 дней.
Материалом служили кровь и печень крыс. Взятие биоматериала проводили в утренние часы после декапитации животных под эфирным наркозом. Определяли концентрацию промежуточных (ДК) и конечных (МДА) продуктов липопероксидации [1, 8]. МДА выделяли из эритроцитарных мембран изопропиловым спиртом [8]. Методика определения МДА в гомогенате печени аналогична его определению в мембранах эритроцитов. Липидную фракцию для определения диеновых конъюгатов (ДК) в эритроцитах крови и гомогенатах печени экстрагировали гептан-изопропаноловой смесью методом, модифицированным П.И. Цапок с соавт. (1999) [8]. Данные обработаны методами вариационной статистики с применением критерия Mann-Whitne.
Результаты исследования и их обсуждение
При моделировании острого гепатита 4 инъекциями CCl4 в обеих контрольных группах наблюдалась тенденция к снижению содержания ДК в плазме крови (рис. 1), сохраняющаяся при введении озона в дозах 1 и 10 мкг/кг. Введение озона в дозе 100 мкг/кг приводило к увеличению показателя на 31,3 % (р < 0,05) к опытному контролю. При этом содержание ДК в плазме крови зависело от дозы озона (r = +0,59). В эритроцитах крыс контрольных групп содержание ДК оставалось в пределах нормы, а введение 1 мкг/кг озона приводило к увеличению показателя на 58,7 % (р < 0,01) к опытному контролю и на 44,7 % (р < 0,05) - к норме. При введении 10 мкг/кг озона выявлено снижение содержания ДК на 28,1 % (р < 0,05) по отношению к норме. В гомогенате печени через сутки после отмены токсина содержание ДК было выше нормы на 83,1 %, а к 10 суткам данный показатель снизился до нормы. При введении озона в дозе 1 мкг/кг значение ДК сохранялось на высоком уровне, превышая данный показатель животных опытного контроля на 57,5 % (р < 0,05), а нормальные значения - на 32,6 % (р < 0,05). Введение озона в дозе 10 мкг/кг приводило к снижению содержания ДК до уровня опытного контроля и нормы, в то время как при использовании дозы озона 100 мкг/кг наблюдалось снижение данного показателя по отношению к норме на 30,1 % (р < 0,05), а по отношению к опытному контролю изменений не было. Между содержанием ДК в ткани печени и дозой вводимого озона обнаружена обратная зависимость (r = -0,48).
Рис. 1. Динамика содержания диеновых конъюгатов в биосредах крыс при введении озона
в условиях острого токсического поражения тетрахлорметаном (4 инъекции)
В модели острого гепатита после 4 инъекций токсина изменений содержания МДА в плазме крови крыс контрольных групп не выявлено (рис. 2). При введении 1 мкг/кг озона показатель остается в пределах нормы и значений контрольных групп. С увеличением дозы озона (10 мкг/кг) наблюдается снижение концентрации МДА к норме на 19,6 % (р < 0,05). При дальнейшем увеличении дозы озона выявлено нарастание содержания МДА в плазме на 60,3 % (р < 0,01) к опытному контролю и на 62,9 % (р < 0,01) - к норме. Корреляционный анализ выявил прямую корреляцию между уровнем МДА плазмы и дозой озона (r = +0,82). В эритроцитах крыс контрольных групп содержание было нормальным. Введение 1 мкг/кг озона вызывало снижение содержания МДА в эритроцитах крови крыс на 22,1 % (р < 0,05), а 10 мкг/кг - увеличение показателя на 27,1 % (р < 0,05) к опытному контролю. Использование 10 и 100 мкг/кг озона приводило к увеличению концентрации МДА на 63,4 % (р < 0,01) и 62,3 % (р < 0,05) по отношению к норме соответственно. При этом содержание МДА в эритроцитах напрямую зависело от дозы вводимого озона (r = +0,42). В гомогенате печени крыс гепатитного контроля обнаружено увеличение уровня МДА в 2,82 раза (р < 0,05), к 10 суткам - его снижение без достижения нормы (выше ее на 75 %). При введении 1 и 10 мкг/кг озона содержание МДА оставалось выше нормы на 55,9 % (р < 0,05) и 50,5 % (р < 0,05) соответственно, а при введении 100 мкг/кг озона показатель, снижаясь, не отличался от нормы (р > 0,05). Также выявлена зависимость между уровнем МДА гомогената печени и дозой озона (r = -0,39).
Рис. 2. Динамика содержания малонового диальдегида в биологических средах крыс при введении озона при остром токсическом поражении (4 инъекции тетрахлорметана)
Введение озона при хроническом гепатите приводило к существенным сдвигам содержания ДК плазмы (рис. 3). Так, через 1 сутки после отмены токсина наблюдалось снижение уровня ДК на 76 %, а к 10 суткам - его восстановление до нормы. При введении 1 мкг/кг озона показатель не отличается от опытного контроля и нормы, а применение 10 и 100 мкг/кг озона приводило к снижению концентрации ДК плазмы на 46 % (р < 0,05) и 89,1 % (р < 0,01) по отношению к опытному контролю соответственно и к норме -на 57,5 % (р < 0,05) и 91,2 % (р < 0,05) соответственно. Между уровнем ДК плазмы и дозой озона выявлена обратная корреляция (r = -0,79). В эритроцитах через сутки после отмены токсина выявлено снижение уровня ДК на 38,3 % (р < 0,05) к норме, к 10 суткам - на 77,9 % (р < 0,01). При введении 1 и 10 мкг/кг озона содержание ДК эритроцитов увеличилось к опытному контролю в 3,34 раза (р < 0,01) и 2,93 раза (р < 0,01) соответственно. В первом случае показатель нормализовался, а при введении 10 мкг/кг - оставался сниженным на 35,3 % (р < 0,05). Введение 100 мкг/кг озона приводило к сохранению значения на уровне опытного контроля (на 70 % ниже нормы; р < 0,01). В гомогенате печени уровень ДК через сутки после отмены токсина превышал норму в 1,9 раза, к 10 суткам происходит его нормализация. Введение озона изменяет параметр лишь по отношению к интактным животным и только в дозе 100 мкг/кг (снижение уровня ДК гомогената печени на 39,1 %; р < 0,05). С увеличением дозы озона наблюдается снижение концентрации ДК (r = -0,40).
Рис. 3. Изменение содержания диеновых конъюгатов в биологических средах крыс при введении озона при хроническом токсическом поражении (20 инъекций тетрахлорметана)
Рис. 4. Динамика концентрации МДА в плазме и эритроцитах крови крыс при введении озона
в условиях хронического токсического поражения тетрахлорметаном (20 инъекций)
В рассматриваемой модели изменения уровня МДА в плазме крови крыс опытных групп выявлены лишь при введении 10 мкг/кг озона (снижение к опытному контролю на 51 %; р < 0,05) (рис. 4). При введении озона параметр был снижен на 42,8 % (р < 0,01), 64,1 % (р < 0,01) и 34,5 % (р < 0,05) к норме соответственно. В эритроцитах крыс гепатитного контроля наблюдалось снижение содержания МДА на 36 % (р < 0,05) к норме, а через 10 суток после отмены гепатотоксина - восстановление до нормы. В опытных группах изменения уровня МДА выявлены лишь при введении 100 мкг/кг озона (снижение к опытному контролю на 33,6 %; р < 0,05), а к норме - на 35,1 % (р < 0,05). Между содержанием МДА в эритроцитах и дозой озона выявлена обратная зависимость (r = -0,56). Изменения МДА в гомогенате печени крыс носят выраженный характер (рис. 5). Так, наблюдаемое через сутки после отмены токсина увеличение показателя к 10 суткам снижается, не достигая нормы и превышая ее в 2,2 раза (р < 0,05). При введении 1 мкг/кг озона параметр, снижаясь, оставался выше значений опытного контроля на 33,2 % (р < 0,05) и превышал норму в 4,3 раза (р < 0,05). При введении 10 мкг/кг озона уровень параметра не отличался от опытного контроля, превышая норму в 3,9 раза (р < 0,05). При введении озона в дозе 100 мкг/кг наблюдалось снижение концентрации МДА по отношению к опытному контролю на 37,2 % (р < 0,01), но данный показатель оставался выше нормы в 2,02 раза (р < 0,05).
Рис. 5. Изменение содержания малонового диальдегида в гомогенате печени крыс при введении озона при тяжелой интоксикации (20 инъекций тетрахлорметана)
При воспроизведении цирроза печени через сутки после отмены гепатотоксина в плазме наблюдалось снижение концентрации ДК по отношению к норме на 48,2 % (р < 0,05), а к 10 суткам - до следовых количеств (0,005 ± 0,002 усл. ед./л). Введение озона приводило к увеличению содержания показателя к опытному контролю, относительно нормы он оставался ниже на 55,3 % (р < 0,05), 66,6 % (р < 0,05) и 93,3 % (р < 0,05) соответственно (рис. 6). При введении озона показатель в эритроцитах снижался по отношению к интактным животным на 83,4 % (р < 0,01), 90,6 % (р < 0,01) и 77,3 % (р < 0,01) соответственно (корреляция с дозой озона r = +0,47). В гомогенате печени увеличение содержания ДК, наблюдаемое через сутки после отмены тетрахлорметана, сменялось его снижением до нормы к 10 суткам. Введение озона в дозах 1 и 10 мкг/кг также приводило к снижению концентрации ДК до уровня опытного контроля, не отличаясь от нормы. Введение 100 мкг/кг озона приводило к снижению показателя, но он оставался выше опытного контроля на 76,4 % (р < 0,05) и нормы на 97,9 % (р < 0,01).
Рис. 6. Динамика концентрации диеновых конъюгатов в биосредах крыс при введении озона
при моделировании токсического поражения 64 инъекциями тетрахлорметана
В плазме крови животных гепатитного контроля содержание МДА оставалось в пределах нормы, в то время как в группе опытного контроля снижалось до следовых количеств (0,29 ± 0,1 мкмоль/л). При введении озона в дозах 1 и 100 мкг/кг содержание данного показателя сохранялось нормальным, в то время как при применении дозы 10 мкг/кг оно росло по отношению к норме (на 30,3 %; р < 0,05). В эритроцитах крыс контрольных групп содержание МДА оставалось физиологическим. При введении озона наблюдалась обратная зависимость между содержанием МДА в эритроцитах крови крыс и дозой озона (r = -0,74). Введение 100 мкг/кг озона приводило к снижению показателя на 38,8 и 50,7 % (р < 0,05) к опытному контролю и к норме соответственно (рис. 7).
Рис. 7. Изменение концентрации малонового диальдегида в плазме и эритроцитах крови крыс
при введении озона при интоксикации 64 инъекциями тетрахлорметана
При циррозе печени наиболее выраженные изменения содержания МДА выявлены в гомогенате печени крыс. Так, через сутки после отмены тетрахлорметана наблюдалось увеличение данного параметра в 6,1 раза (р < 0,05) по отношению к норме, а к 10 суткам он снижался, оставаясь выше нормы в 2,9 раза (р < 0,05). При использовании доз 1 и 10 мкг/кг уровень МДА гомогената печени снижался, превышая значения опытного контроля на 59 % (р < 0,01) и 35,5 % (р < 0,05) соответственно, а норму - в 6,1 раза (р < 0,05) и в 5,2 раза (р < 0,05) соответственно. Введение 100 мкг/кг озона приводило к снижению показателя до уровня опытного контроля, но он оставался выше нормы в 3,4 раза (р < 0,05).
Заключение
Таким образом, экспериментально показано, что при остром токсическом гепатите наиболее эффективны низкие дозы озона (1 и 10 мкг/кг), а при хроническом гепатите и циррозе печени требуются высокие дозы озона (10 до 100 мкг/кг).
Список литературы
- Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. - СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. - 104 с.
- Бояринов Г.А. Озонированное искусственное кровообращение. - Н. Новгород: Покровка, 1999. - 318 c.
- Буеверов А.О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени // Росс. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. - № 4. - С. 21-25.
- Роль перекисного окисления липидов в механизме пролиферации фиброзной ткани печени при экспериментальном хроническом гепатите / А.И. Венгеровский [и др.] // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1996. - № 2. - С. 37-39.
- Восстановление экскреторной функции печени антиоксидантами при токсическом гепатите / Л.Ф. Виноградова [и др.] // Вестник РУДН, сер. Медицина. - 2000. - №2. - С. 53-55.
- Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование озонотерапии постгеморрагического периода: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Казань, 1991. - 29 с.
- Скровцов В.В. Пероксидация липидов и антиоксидантная система в гепатологии // Гепатология. - 2003. - № 3. - С. 7-13.
- Цапок П.И. с соавт. Метод обработки эритроцитарных мембран для биохимических исследований // Инф. листок № 72-99 ЦНТИ. - Киров - 1999. - 3 с.
- Bocci V. Ozone as a bioregulator. Pharmacology and toxicology of ozone therapy today // J. Biolog. Regulators and Homeostatic agents. - 1997. - Vol. 10, № 2/3. - P. 31-53.
- Pera N., Phung N., Farrel G.C. Oxidative stress in hepatic fibrogenesis: implications from a nutritional model of nonalcoholic steatohepatitis // Hepatology. - 1999. - Vol. 30. - P. 493-494.
Рецензенты:
Потемина Т.Е., д.м.н., зав. кафедрой патологической физиологии ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия», г. Нижний Новгород;
Артифексова А.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической анатомии ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия», г. Нижний Новгород.