В многочисленных исследованиях последних лет доказано, что в молекулярных механизмах патогенеза многих заболеваний ключевую роль играет дисбаланс в системе свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты [8]. Избыток свободных радикалов негативно влияет на структуру любых молекул клетки, наиболее интенсивно повреждая липиды. Активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), накопление свободных радикалов нарушают структурно-функциональную целостность клеточных мембран, и, как следствие, влияют на течение биоэнергетических процессов. В то же время имеются данные, согласно которым при гипоксии усиливается свободнорадикальная активность [1]. Это запускает порочный круг клеточной патологии, ведущий к утрате барьерных свойств мембран.
Клиническая медицина постоянно сталкивается с необходимостью защиты организма от недостатка кислорода, с одной стороны, и его повреждающим действием, с другой. В этих случаях целесообразно использовать соединения с общеклеточным действием, обладающие антиоксидантной, антигипоксической и мембранопротекторной активностями. Коррекция развивающихся нарушений при избыточной активации процессов свободнорадикального окисления (СРО) и недостаточности антиоксидантной защиты с помощью препаратов, обладающих антиоксидантной и антигипоксической активностями, является наиболее универсальной. К числу эффективных средств, в значительной степени обладающих указанными свойствами, могут быть отнесены производные пиримидина и их комплексные соединения с карбоновыми кислотами. Одним из данных соединений является комплекс 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой. Целью настоящей работы явилось исследование антирадикальной, антиокислительной, антигипоксической активности комплексного соединения 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой.
Материалы и методы исследования
Влияние комплекса 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой на процессы генерации свободных радикалов in vitro оценивали в хемилюминесцентных модельных системах. Данное соединение синтезировано по методике, разработанной в Институте органической химии УНЦ РАН д.х.н. В.П. Кривоноговым. В качестве первой использовали модельную систему, состоящую из смеси этилбензол: ледяная уксусная кислота (3:2), в которой содержался активатор - 1,4 дибромантрацен (500 мкмоль), инициатор - азодиизобутиронитрил (100 мкмоль) и изучаемое соединение. В данной системе исследуется антагонизм препаратов с органическим радикалом типа RO2 путем определения величины константы К7, которая характеризует скорость взаимодействия перекисных радикалов этилбензола с молекулами изучаемого соединения. Данную величину сравнивали с К7 ионола [9].
В качестве второй модели использовали систему, где генерировалось образование активных форм кислорода (АФК). Для этого использовали фосфатный буфер (КН2РО4 - 20 ммоль, КСl - 105 ммоль, РН 7,45) с добавлением цитрата натрия (50 ммоль) и люминола (5-амино, 2,3 дегидро-4-фталазиндион, 10 мкмоль). Образование АФК инициировали введением сернокислого железа (2,5 ммоль).
Для оценки антиокислительной активности препаратов на процессы перекисного окисления липидов использовали модельную систему, содержащую липидно-белковые комплексы из гомогенизированного куриного желтка, соответствующие по составу липопротеидам крови низкой и очень низкой плотности, а также использовали систему плазмы крови человека. Окисление липидов инициировалось добавлением сернокислого железа (конечная концентрация 2,5 ммоль), которое катализировало окисление ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов. По интенсивности развивающегося свечения судили о процессах ПОЛ. Контролем служили модельные системы без добавления препарата.
Хемилюминесцентные измерения проводили с помощью хемилюминометра ХЛМ-003, который измеряет излучение с длиной волны 0,3-0,6 мкм, чувствительность составляет 104-107 фотон/с. В ка-
честве эталона при оценке интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) использовали ЖС-19(ГОСТ 9411-81), испускающий свет в видимой области спектра и прокалиброванный в абсолютных единицах по стандартному радиолюминесцентному источнику. Кинетику хемилюминесценции регистрировали и обрабатывали с помощью интерфейса, связанного с компьютером. Программа определяет следующие параметры хемилюминесценции: светосумму, спонтанную светимость, вспышку, максимальную светимость и наклон кривой. В качестве наиболее информативных показателей ХЛ были взяты светосумма (S) и максимальная светимость (I max).
Антигипоксическую активность соединения изучали на моделях острой гемической гипоксии (ОГеГ), острой гистотоксической гипоксии (ОГТГ), острой гипоксии с гиперкапнией (ОГГК) в соответствии с «Методическими рекомендациями по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств» Фармакологического государственного комитета МЗ СССР(1990).
Опыты по изучению действия гемической гипоксии проводили на крысах-самцах массой 180-240 г. Гемическую гипоксию вызывали подкожным введением нитрита натрия в дозе 90 мг/кг, вызывающего гибель 50 % животных (LD50). В эритроцитах крыс определяли общий уровень аденозинтрифосфата (АТФ)[2], активность супероксиддисмутазы [6], каталазы [4], глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [10], а также содержание восстановленного глутатиона [7] и диеновых конъюгатов [3].
Комплекс 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой вводили внутрижелудочно на 2 % крахмальной взвеси в дозе 50 мг/кг ежедневно с интервалом 12 часов в течение 5 дней, начиная с момента введения токсиканта. В контрольной группе крыс вводили растворитель. Тестирование осуществляли на 7 сутки. Эксперименты проводили в соответствии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от10.10.83 г., №267 МЗ РФ 19.06.03 г. «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных».
Обработку полученных результатов проводили с применением методов вариационной статистики. В сравниваемых группах определяли средние величины (М), ошибку средних величин( ± m). Оценку достоверности проводили по критерию Стьюдента (t). Минимальный уровень достоверности верифицировали при p < 0,05. Математическую обработку выполняли на компьютере с применением программного обеспечения Microsoft Excel.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследованное комплексное соединение 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой является активным ингибитором свободнорадикального окисления в системе инициированного окисления этилбензола. Константа скорости взаимодействия перекисных радикалов этилбензола (константа К7) с изучаемым соединением составила (2,22 ± 0,2)·104 л/(моль·с). Соотношение константы взаимодействия перекисных радикалов исследуемого соединения к К7 ионола составила 0,96, что говорит о высокой антирадикальной активности, сопоставимой с ингибирующим эффектом ионола. Выявленный антагонизм указанного соединения с радикалом типа LO2˙ имеет большое значение, так как по современным представлениям имеется всего два типа непосредственных «радикалов-убийц» - это гидроксильный радикал и один из липидных радикалов - L˙, LO˙ и LO2˙, а возможно все три.
Из данных, представленных в табл. 1, следует, что добавление 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой в концентрации 10-4 М в модельную систему, в которой осуществляются процессы генерации активных форм кислорода (АФК), вызывает уменьшение светосуммы хемилюминесценции на 42,1 % (p < 0,05) в сравнении с контролем, а в концентрации 10-3 М генерация АФК практически полностью прекращается. Угнетающее воздействие комплекса на люминолзависимую хемилюминисценцию является показателем его способности подавлять выработку первичных свободных радикалов, образующихся путем одноэлектронного восстановления с участием ионов переменной валентности.
Таблица 1
Влияние комплекса 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой на параметры модельных систем, инициирующих реакции липопероксидации и генерирующих активные
формы кислорода (M ± m)
|
Препарат |
Концентр. в системе |
ХЛ желточных липопротеидов |
ХЛ плазмы крови человека |
ХЛ системы генерирующей АФК |
|||
|
S, усл.ед. |
I, усл.ед. |
S, усл.ед. |
I, усл.ед. |
S, усл.ед. |
I, усл.ед. |
||
|
Контроль |
119,0 ± 3,7 |
22,13 ± 1,4 |
2,15 ± 0,01 |
0,64 ± 0,03 |
67,16 ± 1,5 |
44,85 ± 1,7 |
|
|
Комплекс 5-окси-6-метилурацила с ЯК (n = 10) |
10-4 М |
56,25 ± 2,4* |
12,38 ± 1,2* |
1,69 ± 0,02* |
0,45 ± 0,05* |
38,87 ± 1,2* |
32,65 ± 1,1* |
|
Комплекс 5-окси-6-метилурацила с ЯК (n = 10) |
10-3 М |
23,48 ± 0,9* |
5,46 ± 0,5* |
0,87 ± 0,05* |
0,28 ± 0,01* |
1,92 ± 0,03* |
1,1 ± 0,02* |
Примечание: * - достоверно (p < 0,05) по сравнению с контролем.
Для оценки влияния препаратов на процессы перекисного окисления липидов были использованы модельные системы, содержащие липидно-белковые комплексы из гомогенизированного куриного желтка, соответствующие по составу липопротеидам крови низкой и очень низкой плотности, а также плазме крови человека. По полученным данным, введение комплексного соединения 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой в концентрации 10-4 М в модельную систему желточных липопротеидов вызывало снижение интенсивности хемилюминисценции по сравнению с контрольным результатом на 52,7 % (p < 0,05), а введение в плазму крови ‒ на 21,4 % (p < 0,05). С увеличением концентрации препарата происходило усиление подавления ХЛ. Воздействие комплексного соединения 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой более выражено в липопротеидах желтка, здесь при добавлении препарата в концентрации 10-3 М происходило угнетение ХЛ на 80,2 % (p < 0,05) от контроля, в то время как в плазме крови ‒ на 59,5 % (p < 0,05). Эти результаты можно объяснить более сложным липидным составом плазмы в сравнении с липидами куриного желтка и большей окисляемостью не входящих в состав куриного желтка липидов.
Гипоксия одна из основных причин нарушений метаболизма и функции клеток при многих патологических состояниях. Возникающие серьезные нарушения окислительного и энергетического метаболизма клетки требуют поиска средств, ограничивающих активацию оксидативного стресса и оказывающих корригирующее влияние на метаболические процессы. Данное направление опирается на современные представления о важной роли активации процессов ПОЛ и состояния антиоксидантной системы в патогенезе, течении и прогнозе патологии гипоксической природы [5].
Проведенные исследования, представленные в табл. 2, свидетельствуют о наличии противогипоксической активности у комплексного соединения 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой. Данное соединение увеличивает время жизни мышей на модели гиперкапнической гипоксии в 1,76 раза (p < 0,05), что сопоставимо по эффективности с действием этомерзола. Известно, что гиперкапния повышает выброс катехоламинов, который приводит к спазму артериол, росту периферического сопротивления, выраженным нарушениям реологических свойств крови. Значительное увеличение времени жизни на модели ОГГК позволяет рассматривать это соединение, как средство эффективное при состояниях, связанных с избыточным накоплением углекислого газа.
В условиях гистотоксической гипоксии соединение повышало выживаемость животных на 48 % (p < 0,05). Эффективность этомерзола на данной модели равна 84,1 %. При тканевой гипоксии нарушается утилизация кислорода вследствие снижения количества или инактивации дыхательных ферментов и разобщения окисления и фосфорилирования. Возникновение тканевой гипоксии может быть обусловлено и активацией свободнорадикального окисления. В связи с этим увеличение времени жизни при введении комплекса свидетельствует о его способности ограничивать метаболические нарушения.
Таблица 2
Влияние комплекса 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой на продолжительность жизни белых мышей при ОГеГ, ОГТГ и ОГКГ (М ± m)
|
Номер серии |
Препарат |
Доза мг/кг |
ОГеГ (n = 8) |
ОГТГ (n = 8) |
ОГГК (n = 8) |
|||
|
Время |
% от контр. |
Время |
% от контр |
Время |
% от контр. |
|||
|
1 |
Контроль |
14,64 ± 1,2 |
100 |
18,37 ± 2,5 |
100 |
15,77 ± 1,1 |
100 |
|
|
Комплекс 5-окси-6-метилурацила с ЯК |
100 |
15,74 ± 2,0 |
107,5 |
27,16 ± 2,1* |
147,8 |
27,72 ± 1,2* |
175,8 |
|
|
2 |
Контроль |
10,2 ± 0,8 |
100 |
24,5 ± 2,0 |
100 |
16,6 ± 0,8 |
100 |
|
|
Этомерзол |
50 |
16,9 ± 0,8* |
166 |
45,1 ± 4,3* |
184,1 |
31,5 ± 2,8* |
189,7 |
|
Примечание: * - достоверно (p < 0,05) по сравнению с контролем.
Особенность патологического процесса при гипоксии, вызванной введением токсических доз нитрита натрия, состоит в том, что метгемоглобинизирующее действие токсиканта дополняется оксидативным стрессом с ингибированием ферментов дыхательной цепи митохондрий, что ведет к нарушению их функционального состояния и метаболическим расстройствам. Данное соединение значительно не увеличивает продолжительность жизни белых мышей при введении летальных доз нитрита натрия. В то же время у крыс при введении токсиканта в дозе LD50 комплексное соединение 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой улучшало окислительно-энергетический потенциал эритроцитов. Как следует из данных, представленных в табл. 3, введение нитрита натрия подавляло активность ферментов антиоксидантной защиты - каталазы и СОД, снижало уровень АТФ и существенно повышало количество ДК в эритроцитах. Эритроциты чувствительны к окислительному стрессу из-за повышенного содержания в мембране полиненасыщенных жирных кислот, высокой концентрации кислорода в клетке и отсутствия возможности ресинтезировать поврежденные структуры. Снижение уровня восстановленного глутатиона и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) служит отражением дисбаланса глутатионовой системы защиты клеток от свободнорадикального повреждения. Известно, что эритроциты содержат богатые запасы глутатиона, причем 95 % приходится на восстановленную форму. Глутатион участвует как в индуцированной глутатионпероксидазной реакции, так и в поддержании восстановленного состояния сульфгидрильных групп белковых молекул, редокс-статуса аскорбата и клетки в целом. Соотношение окисленных и восстановленных форм глутатиона зависит от скорости реакций пентозного цикла, ключевым ферментом которого является Г6ФДГ. Наблюдаемое уменьшение концентрации АТФ в эритроцитах приводит к снижению скорости образования восстановленных эквивалентов, тем самым повышается опаность окислительного разрушения эритроцитов.
В эритроцитах, отравленных нитритом натрия, крыс, которым вводили комплексное соединение 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой, выраженность изменений активности каталазы, СОД, общего уровня АТФ, восстановленного глутатиона была достоверно ниже, чем в контроле и приближалась к аналогичным показателям интактных животных. Учитывая важную роль в патогенезе гипоксий свободнорадикальных процессов, можно сказать, что восстановление окислительного гомеостаза составляет важное звено в терапии гипоксического синдрома при гемической гипоксии.
Заключение. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что комплексное соединение 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой обладает антирадикальной, антиокислительной активностью и повышает устойчивость животных к состояниям, характеризующимся дефицитом кислорода. Данное соединение ограничивает развитие гипоксического порочного круга, когда снижение активности ферментов антиоксидантной защиты сопряжено с интенсификацией процесса липопероксидации, а это, в свою очередь, провоцирует снижение активности ферментов, участвующих в поддержании окислительного и энергетического гомеостаза.
Таблица 3
Влияние комплекса 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой
на окислительно-энергетический потенциал эритроцитов при интоксикации нитритом натрия
|
Показатель |
Интактные |
Нитрит натрия |
Нитрит натрия + комплекс 5-окси-6-метилурацила |
|
ДК(λ = 232), усл. ед. на 1 мл крови |
2,53 ± 0,2 |
4,48 ± 0,24* |
3,1 ± 0,18*^ |
|
Каталаза, ммоль в мин на 1 мг гемоглобина |
92,7 ± 4,2 |
59,5 ± 4,8* |
87,2 ± 3,6^ |
|
СОД, усл.ед. на 1 мг гемоглобина |
1,9 ± 0,09 |
0,78 ± 0,03* |
0,92 ± 0,02*^ |
|
АТФ, мкмоль на 1 мл эритроцитов |
1,8 ± 0,19 |
0,7 ± 0,1* |
1,4 ± 0,2^ |
|
Г6ФДГ, нмоль в мин на 1 мг гемоглобина |
14,5 ± 0,5 |
12,8 ± 0,66* |
16,2 ± 0,33*^ |
|
Восстановленный глютатион, мг % |
78,3 ± 3,5 |
53,7 ± 4,1* |
72,3 ± 3,9^ |
Примечание: * - различие достоверно (р < 0,05) по сравнению с интактными животными.
^ - различие достоверно (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой.
Список литературы
- Активация свободнорадикального окисления - эфферентное звено типовых патологических процессов / под ред. Н.П. Чесноковой, М.Ю. Ледванова. - Саратов: Изд-во Саратов. мед. ун-та, 2006. - 177 с.
- Виноградов И.Л., Багрянцева С.Ю., Дервиз Г.В. Метод одновременного определения 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах // Лаб. дело. - 1980. - № 7. - С. 424-426.
- Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови / И.А. Волчегорский, А.Г. Налимов, Б.Г. Яровинский, Р.И. Лифшиц // Вопр. мед. химии. - 1989. - № 1. - С. 127-130.
- Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-18.
- Лукьянова Л.Д. Новые подходы к созданию антигипоксантов метаболического действия // Вестник РАМН. - 1999. - №3. - С. 18-25.
- Макаренко Е.В. Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в эритроцитах у больных с хроническими заболеваниями печени // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 48-50.
- Путилина Е.Ф. Определение восстановленного глутатиона в тканях. Методы биохимических исследований. - Л.: 1982. - С. 183-187.
- Чеснокова Н.П.,Моррисон В.В.,Понукалина Е.Ф.,Афанасьева Г.А.,Бизенкова М.Н.,Барсуков В.Ю., Морозова О.Л.,Полутова Н.В., Жевак Т.И. О роли активации свободнорадикального окисления в структурной и функциональной дезорганизации биосистем в условиях патологии // Фундаментальные исследования. - 2009. - №5. - С. 122-130.
- Шляпинтох В.Я. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. - М.: Наука, 1966.
- Glock G., MeLean P. Further studies on the properties and assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase of rat liver // Biochem. - 1953. - Vol. 55, № 3. - P. 400-408.
Рецензенты:
Минибаев М.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», г. Казань;
Овсянников В.Г., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет», г. Ростов-на-Дону.