Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Патогенетические механизмы повреждения печени многообразны и универсальны, т.е. реализуются независимо от этиологического фактора. Конечными этапами патологического процесса в печеночной паренхиме является запуск гипоксического или свободнорадикального некробиоза с последующей клеточной гибелью [1]. К механизмам клеточной гибели в условиях гипоксии различного генеза (в том числе, тканевой) относятся дефицит энергии, ионный дисбаланс, накопление внутриклеточного кальция и дефицит ростовых факторов [8]. Разобщение окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи в условиях гипоксического стресса или избыточной продукции активированных метаболитов кислорода приводит к уменьшению количества АТФ, что нарушает функционирование регуляторов ионного баланса, гарантирующих целостность мембранных структур. Накопление внутриклеточного кальция запускает ряд внутриклеточных катаболических каскадов, увеличивая образования свободных радикалов. Эти механизмы способствуют формированию мембранных пор проницаемости в митохондриях (PT поры), чему способствует и высвобождение цитохрома С из межмембранного пространства в цитозоль, что запускает митохондриальный механизм апоптоза [12, 14, 15].

Для хронических повреждений печени с разным инициирующим агентом характерно развитие цитолиза, воспалительной реакции, с последующим прогрессированием фиброза. [6, 9]. В патогенезе повреждения гепатоцитов важна роль тканевой гипоксии, приводящей к нарушению функций митохондрий, истощению запасов АТФ, активации свободнорадикальных процессов [7, 11]. Гипоксическое повреждение печени обусловлено активными кислородными метаболитами, синтезируемыми компонентами системы мононуклеарных фагоцитов - клетками Купфера [4, 7, 10, 11, 13].

Арсенал лекарственных средств, ориентированных на лечение хронических поражений печени включает средства метаболической терапии, эффективность которых не всегда достаточна. Это обусловило включение в разрабатываемые оригинальные композиции митохондриального субстрата (янтарная кислота, сукцинат) [2]. Созданные лекарственные средства выделены [3] в фармацевтическую группу, названную «субстратами энергетического обмена» или «субстратными антигипоксантами». Их действие носит неспецифический характер, восстанавливая пул внутриклеточных макроэргов и уменьшая уровень активных метаболитов кислорода, повышая клиническую эффективность терапии [8].

Материалы и методы

Для изучения на животных токсического поражения печени были взяты 49 особей белых беспородных мышей (интактная группа - 10, две основные группы по 13 и контрольная группа - 13 мышей). Токсическое поражение печени вызвано отравлением грибами. Материал для исследования - экстракт грибов, включает токсины: a-аманитин - 396,3 мкг/мл, b-аманитин - 172,6 мкг/мл, фаллоцидин - 193,3 мкг/мл, фаллоидин - 101,8 мкг/мл. Экстракт грибов вводился в дозе 1 ЛД50 - 0,67 ± 0,21 мл/10 г.

Фармакотерапевтическая активность ремаксола изучена на модели аденовирусного гепатита. Оценка препарата проводилась по результатам биохимического обследования животных.

Клиническая картина в группе мышей с отравлением грибами без лечения характеризовалась гиподинамией, заторможенностью, взъерошенностью шерсти и неопрятностью животных. В этой группе к 3-му дню наблюдения погибли все животные.

Интоксикация грибами сопровождалась нарушением белково-синтетической, детоксицирующей, липосинтезирующей функций печени, признаками цитолиза.

Отмечено снижение (в 1,9 раза) уровня белка сыворотки крови, составив соответственно 28,0 ± 4,0, против 54,0 ± 2,0 г/л, наблюдалось падение (в 1,5 раза) уровня липидов и холестерина. При токсическом поражении печени повышалась в 13,6 и 2,3 раза активность печеночных ферментов (табл. 4), уровень билирубина вырос в 1,9 раза, ЛДГ в 1,8 раза, тимоловой пробы - в 3,5 раз. На этом фоне отмечено падение (в 8,3 раз) концентрации сульфгидрильных групп, уровня гликогена (в 5,2 раза), а содержание восстановленного глютатиона снизилось в 2,7 раза, составив 51,0 ± 7,5, против 136,0 ± 7,0 мг % (табл. 1).

Таблица 1

Биохимические показатели при токсическом поражении печени

Примечание: * - различия достоверны в сравниваемых группах (р < 0,05).

Фармакотерапевтическую эффективность сукцинатсодержащих препаратов (ремаксола и цитофлавина) оценивали по выживаемости животных и биохимическим показателям.

В группе животных, получавших с целью лечения препарат цитофлавин (n = 13), к 3-му дню выжило 4 мыши из 13, в группе животных, получавших ремаксол (n = 13) 2 из 13, что соответственно составило 30,8 и 15,4 %, против 100 % летальности в группе животных без проведения терапии. Применение сукцинатсодержащих препаратов частично нормализовало функциональную активность печени, причем цитофлавин был более активным, снижая (в 1,4 раза) уровень билирубина, в сравнении с ремаксолом. Отмечено и значительное падение (в 4 раза) уровня цитолиза под воздействием цитофлавина, тогда как под влиянием ремаксола цитолиз снижался в 2,6 раза.

Таблица 2

Влияние сукцинатсодержащих препаратов на функциональные показатели печени
при ее токсическом поражении

Примечание: * - различия достоверны в сравнении с группой животных без лечения.

На фоне аденовирусного гепатита у животных отмечался выраженный цитолиз, превышающий уровень нормы в 9,5 раза, по АлАТ, что составило 1,9 ± 0,2 мккат/л против 0,20 ± 0,003 мккат/л

Уровень щелочной фосфатазы также превышал норму в 3,1 раза, на фоне билирубинемии, превышающей норму в 2.4 раза (7,2 ± 0,1, против 3,0 ± 0,3 ммоль/л). Активность каталазы снижена в 2,4 раза, составив 190 ± 23, против 450 ± 20 мг/мл⋅мин. На фоне умеренной интоксикации при повышенном уровне МДА (в 3,2 раза), в сравнении с нормой, отмечено снижение (в 2,4 раза) резерва SH-групп при умеренном падении уровня холестерина (в 1,1 раза) и в 1.3 раза общих липидов (табл. 3).

Применение сукцинатсодержащих препаратов с целью коррекции установленных нарушений при вирусном поражении печени показало восстановление и/или выраженную тенденцию к нормализации показателей, характеризующих функциональную активность печени (табл. 4).

Таблица 3

Биохимические показатели при вирусном поражении печени (аденовирусный гепатит)

Примечание: * - различия достоверны в сравнении с интактными.

Таблица 4

Влияние сукцинатсодержащих препаратов на функциональную активность печени
при вирусном гепатите

Примечание: * - различия достоверны в сравнении с группой животных без лечения при р < 0,05

Так, цитолиз нормализовался под влиянием терапии ремаксолом, составив 0,27 ± 0,06, при уровне интактных 0,20 ± 0,03 мккат/л; уровень щелочной фосфатазы, содержание ЛДГ и каталазы достигали уровня нормы под воздействием обоих препаратов.

При вирусологическом исследовании ткани печени инфицированных животных титр вируса составил 4,5 ± 0,3 LgТЦД50/мг ткани.

Сукцинатсодержащие препараты не влияли на число пораженных вирусом клеток (колебания от 42 до 58 клеток на 1 мм2 на 3-и сутки наблюдения и от 31 до 49 клеток на 1 мм2 на 7-е сутки наблюдения), и не уменьшали размеров очагов вирусного поражения гепатоцитов, но количество очагов достоверно снижалось под воздействием цитофлавина и составило от 6 до 9 очагов; под воздействием ремаксола - от 3 до 5 очагов, тогда как в группе животных, не получавших лечения, на фоне прогрессирующего вирусного поражения печени число очагов колебалось от 11 до 18 на 10 мм2 площади среза. Можно предполагать о выраженном торможении некротических процессов у гепатоцитов животных, получавших терапию сукцинат содержащими препаратами.

Для установления возможности применения сукцинатсодержащих препаратов при отравлении гепатотоксичными веществами изучены система глютатиона, интенсивность перекисного окисления липидов и процессы клеточного дыхания в ткани печени животных.

Циклофосфан снижал в (3,3 раза) интенсивность утилизации НАД- зависимо окисляемых субстратов до 0,14 ± 0,01, против 0,46 ± 0,01 у интактных животных (табл. 5) за счет с прямого действия токсиканта на ДНК гепатоцитов, приводящего к истощению пула НАД+ в клетках печени. Введение ремаксола предотвращало нарушение интенсивности окисления НАД - зависимо окисляемых субстратов, составив 0,48 ± 0,06, при уровне в группе интактных животных 0,46 ± 0,01 мкл/мг ткани/час.

Таблица 5

Показатели аэробного обмена ткани печени при введении циклофосфана (доза 200 мг/кг)

Примечание: * ‒ различия достоверны в сравниваемых группах.

Внесение в среду инкубации субстрата быстрого НАД- независимого окисления (янтарнокислого натрия) повысило в 2,6 раза скорость потребления кислорода гепатоцитами у животных, получавших ремаксол на фоне интоксикации циклофосфаном, что составило 2,20 ± 0,03, против 0,85 ± 0,03 мкл/мг ткани/час, в группе животных, получавших циклофосфан, что связано со способностью сукцинатсодержащего раствора не только препятствовать деградации мембран митохондрий, но и восстанавливать (+6,1 мкмоль/г ткани) тиол-дисульфидный статус клетки, обеспечивая цитопротекторное действие препарата (табл. 6.).

Токсическое воздействие циклофосфана сопровождалось падением (в 1,4 раза) сульфгидрильных групп (составив 10,62 ± 0,7, против 14,77 ± 0,7 мкмоль/г ткани) у животных, которым не проводилась коррекция препаратами, в сравнении с группой контроля. Ремаксол восстанавливал активность сульфгидрильных групп, восстанавливая тиол-дисульфидный статус гепатоцитов в условиях их лекарственного поражения (табл. 7).

Таблица 6

Влияние ремаксола на сульфгидрильные группы белков ткани печени
при ее токсическом поражении

Примечание: * - различия достоверны в сравниваемых группах.

Таблица 7

Влияние ремаксола на уровень восстановленного глутатиона
при токсическом поражении печени

Примечание: * ‒ различия достоверны в сравниваемых группах.

Введение циклофосфана вызывало снижение (в 2,3 раза) уровня восстановленного глютатиона (табл. 7), в сравнении с показателем контроля, что составило 4,70 ± 0,46, против 10,8 ± 0,7 мкмоль/г ткани. Введение ремаксола увеличило в 1,2 раза уровень восстановления глютатиона, составив 5,61 ± 0,4 мкмоль/г ткани. При этом положительный эффект препарата сохранялся в течение 24-х часов. Установление влияния препарата на обмен глютатиона и состояние тиолдисульфидного равновесия невозможно без комплексного исследования активности ферментов, принимающих участие в восстановлении глутатиона - глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и глутатионредуктазы (табл. 8).

Таблица 8

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ) и глутатионредуктазы (ГР)
в ткани печени экспериментальных животных

Примечание: * ‒ различия достоверны в сравниваемых группах.

Активность Г-6-Ф-ДГ в ткани печени у животных, получивших циклофосфан, в 1,3 раза ниже, в сравнении с интактной группой животных (табл. 8), что указывает на истощение энергетических субстратов гепатоцита, необходимых для осуществления глутатионовой конъюгации и антирадикальной защиты. Поскольку данный фермент ‒ основной источник НАДФН в реакциях пентозо-фосфатного пути окисления глюкозы, являющийся коферментом для редуктазы цитохрома Р₄₅₀ и глутатионредуктазы, то снижение его активности есть показатель крайнего истощения активности систем детоксикации в условиях токсического лекарственного повреждения клеток печени. Введение ремаксола индуцирует фермент, повышая его активность до 15,4 мкмоль/г ткани.

Выявлено падение активности (в 1,2 раза) глутатион -S-трансферазы, у животных, не получавших фармакологической коррекции, в сравнении с группой интактных животных (табл. 9), а введение ремаксола индуцировало активность фермента, уровень которого достиг 572,5 ± 45,0, против 346,8 ± 17,2 мкмоль/гткани, превысив в 1,4 раза показатель интактных животных ‒ 418,2 ± 16,4 мкмоль/г ткани.

Таблица 9

Уровень активности глутатион -S-трансферазы в тканях печени у животных
с токсическим повреждением печени

Примечание:* ‒ различия достоверны в сравниваемых группах.

Более сложная динамика изменений отмечена в активности глутатионредуктазы. У животных, которым был введен гепатотоксикант, не подвергавшихся фармакологической коррекции, уровень фермента превышал (+2,1 мкмоль/г ткани) его уровень у интактных животных. Введение ремаксола привело к повышенной выработке данного фермента, уровень возрос на +24 мкмоль/г ткани, в сравнении с первичным уровнем, превышая уровень животных интактной группы (на 26,6 мкмоль/г ткани). Сходные тенденции установлены нами при изучении влияния ремаксола на уровень каталазной активности в ткани печени животных, получавших гепатотоксикант (табл. 10).

Таблица 10

Уровень активности каталазы у животных с лекарственным повреждением печени

Примечание: * ‒ различия достоверны в сравниваемых группах.

Уровень каталазы на фоне лекарственного повреждения гепатоцитов был в 1,4 раза ниже уровня животных интактной группы (см. табл. 10). У животных, получавших фармакологическую коррекцию ремаксолом, отмечено нарастание (в 1,6 раза) активности каталазы, в сравнении с ее уровнем у животных, не получавших коррекцию, превышая уровень фермента в 1,1 раза в группе контрольных животных, что отчетливо указывает на наличие у сукцинатсодержащего раствора (ремаксола) антиоксидантных свойств.

Уровень малонового диальдегида и концентрация диеновых конъюгат (у животных без лечения) превышал уровень нормы в 2,2 раза, составив соответственно 380,6 ± 15,9, против 175,5 ± 18,8 нмоль/г ткани и 33,51 ± 4,18 (при норме 14,77 ± 0,68 нмоль/г ткани) (табл. 11).

Таблица 11

Уровень активности малонового диальдегида и диеновых конъюгат у животных
с лекарственным повреждением печени

Примечание:*, ** - различия достоверны с группой контроля.

Ремаксол оказывал положительное воздействие на показатели конечных продуктов перекисного окисления липидов в ткани печени экспериментальных животных. Коррекция ремаксолом, нарушенных процессов перекисного окисления липидов, снижала в 1,2 раза уровень малонового диальдегида, превышая в 2,2 раза уровень нормы, уровень диеновых конъюгат под воздействием ремаксола снижался в 1,9 раза, составив 17,45 ± 3,97 при норме 14,77 ± 0,68 нмоль/г ткани (см. табл. 11).

Наблюдалось падение активности (в 1,3 раза) уровня фермента у животных, не получавших коррекцию сукцинатсодержащим препаратом, в сравнении с уровнем фермента интактных животных, что составило 17,86 ± 1,3, против 23,62 ± 2,3  мкмоль/г ткани и нормализовало его уровень после проведения фармакологической коррекции ремаксолом (табл. 12).

Таким образом, изученные сукцинатсодержащие препараты обладают антигипоксантным, антиоксидантным, мембраностабилизирующим и детоксицирующим действием.

Антигипоксический эффект проявляется в способности препаратов янтарной кислоты стимулировать метаболизм НАД-независимых субстратов в условиях действия гепатотоксикантов, что свидетельствует об относительной сохранности аэробного обмена в условиях тканевой гипоксии. Сукцинатсодержащие препараты способствуют поддержанию энергетических субстратов гепатоцитов за счет сохранения активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (поставляющей один из важнейших восстановленных экфивалентов кофакторов - НАДФН), они способны предупреждать оксидативное повреждение глутатионредуктазы и глюкозо- 6-фосфатдегидрогеназы.

Антиоксидантный эффект отмечен при изучении активности каталазы, концентрация которой под влиянием сукцинатсодержащих препаратов, повышалась выше уровня нормы и эффект подтвержден изучением активности глутатионпероксидазы, а также конечных продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида и диеновых конъюгат). Уровень активности антиоксидантной защиты ядер клеток и иных субклеточных структур определяет важнейший фермент внутриклеточной системы детоксикации - глутатион-S-трансфераза, активность которой под влиянием сукцинатсодержащих растворов, возрастает.

Таблица 12

Уровень активности глутатионпероксидазы в ткани печени животных
с ее токсическим повреждением

Примечание: * ‒ различия достоверны в сравниваемых группах.

Мембраностабилизирующий эффект сукцинатсодержащих препаратов сопровождается снижением уровня гидроперекисей липидов и ферментов цитолиза.

Повышая активность Г-6-Ф-ДГ, участвующего в восстановлении уровня глютатиона, ремаксол проявляет цитопротекторные и детоксицирующие свойства.

Указанные свойства сукцинатсодержащих растворов (цитофлавин и ремаксол) позволяют рассматривать их как перспективные гепатопротекторы, нормализующие и/или снижающие уровень цитолиза.

Вышесказанное является обоснованием для изучения сукцинатсодержащих препаратов в клинике в качестве гепатопротекторов при хронических поражениях печени.

Список литературы

1. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П.Основы общей патологии. - СПб., 1999. - С. 85-112.
2. Коваленко А.Л. Фармакологическая активность оригинальных лекарственных препаратов на основе 1-дезокси-1(N-метиламино)-D-глюцитола: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - СПб., 2005. - 48 с.
3. Кожока Т.Г. Лекарственные средства в фармакотерапии патологии клетки. - М., 2007. - 125 с.
4. Лазебник Л.Б., Звенигородская Л.А. Ишемические поражения печени // Хроническая ишемическая болезнь органов пищеварения. - М.: Анахархис, 2003. - С. 72-78.
5. Мартинович Г.Г., Черенкевич С.Н. Окислительно-восстановительные процессы в клетках. - Минск, БГУ, 2007. ‒ 154 с.
6. Никитин И.Г. Гепатопротекторы:мифы и реальные возможности // Фарматека. - 2007. - №13. - С. 14-18.
7. Структурно-функциональные изменения печени при хронических гепатитах и циррозе / С.В. Оковитый, Н.Н. Безбородкина, С.Г. Улейчик, С.Н. Шуленин // Гепатопротекторы. - М., 2010. - С. 17-22.
8. Применение гепатопротективной терапии при лечении хронических заболеваний и поражений печени: Методические рекомендации / под ред. А.Л. Ракова. - М., 2006. - 22 с.
9. Саватеев А.В., Саватеева-Любимова Т.Н. Апоптоз-универсальный механизм гибели и выживания и реперфузии. Пути фармакологического контроля // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - №12. - С. 44-49.
10. Хазанов В.А. Фармакологическая регуляция энергетического обмена // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - №4. - С. 61-64.
11. Чиркин А.А., Данченко Е.О. Биохимия: учебное руководство. -М., 2010. - С. 162-165.
12. Bhogal R.H., Curbishley S.M., Weston C.J. R Reactive oxygen species mediate human hepatocyte injuri during hypoxia|reoxygenation // Liver Transpl. - 2010. - №16. - P. 1303-1313.
13. Maack С., О´Rourke B. Excitation-contraction coupling and mitochondrial energetics // Basic Res.Cardiol. - 2007. - № 102(5). - Р. 369-392.
14. Ripoli M., D..Aprile A. Hepatitis C - virus-linked mitochondrial disfunction promotes hypoxia-inducible factor 1 alpha-mediated glycolytic adaptation // J. Virol. - 2010. - №1. - P. 647-660.
15. Suen D.F., Norris K.L., Youle R.J. Mitichondrial dynamics and apoptosis // Genes. Dev. - 2008. - №22(12). - P. 1577-1590.
16. R.Yamaguchi, G.Perkins. Dynamics of mitochondrial structure during apoptosis and the enigma of Opa1 // Biochem.Biophys. - Acta, 2009. - №1787(8). - P. 963-972.

Рецензент ‒

Антонова Т.А., д.м.н., профессор, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, кафедра инфекционных болезней, Санкт-Петербург.