Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Нарушения слуха (НС) представляют собой сборную группу болезней, объединенных главным симптомом - глухотой или тугоухостью. Доречевые (врожденные и ранние детские) НС - одно из самых частых сенсорных расстройств человека, встречающихся приблизительно у 1 из 1000 новорожденных [1]. Причины, которые способны вызвать этот симптом, многочисленны. Наша работа не касается негенетических факторов, приводящих к врожденной глухоте, таких как инфекционные заболевания (краснуха, отит и менингит), некоторые лекарственные средства (стрептомицин), резус-конфликт матери и ребенка, родовые травмы и др. На их долю по разным оценкам приходится от 30 до 50 % случаев глухоты и тугоухости. Остальную же половину по общему признанию составляют генетические причины [1]. Последнее десятилетие ознаменовалось большими успехами в молекулярной генетике глухоты. Были опубликованы обширные списки генов, мутации хотя бы в одном из которых приводят к серьезным нарушениям слуха в разных человеческих популяциях [7].

Известно, что подавляющее большинство наследственных форм - это аутосомно-рецессивные несиндромальные (моносимптоматические) нарушения слуха (АРНСНС). Несмотря на то, что АРНСНС являются генетически гетерогенными, т.е. к нарушению слуха могут привести мутации в разных генах, наиболее распространенной в странах Европы, США и других популяциях (но не во всех) является глухота, вызванная мутациями в гене GJB2, кодирующем белок щелевых контактов - коннексин 26 (Cx26). Она носит название GJB2-связанной глухоты/тугоухости. Коннексиновый тип глухоты/тугоухости предполагается, если НС являются долингвальными (обнаруживаются при рождении или в раннем детстве), оказываются глубокими, не имеют явной причины, не сопровождаются другими заболеваниями, относятся к аутосомно-рецессивному типу [1].

Генотипирование патогенных мутаций GJB2 гена показало, что они сильно различаются в разных популяциях. У европеоидов самой распространенной является мутация 35delG [10]. В РФ частота мутации 35delG также оказалась чрезвычайно высокой [2, 3]. Вместе с тем эта мутация практически отсутствует в популяциях Ближнего Востока, Юго-Восточной Азии, а также в некоторых популяциях Волго-Уральского региона РФ и Сибири [4, 8, 9]. Но в целом совокупная частота мутаций в GJB2 гене в большинстве стран настолько высока, что ДНК-диагностика наследственных детских НС стала проводиться в первую очередь по этому гену [5].

Вместе с тем существуют значительные различия не только в частоте отдельных мутаций, но и в общем вкладе гена GJB2 (среди других генов) в долингвальные нарушения слуха в разных популяциях. Чтобы оценить степень причастности гена GJB2 к детской глухоте/тугоухости, необходимо провести секвенирование, по крайней мере, всей кодирующей области гена.

Цель настоящей работы - изучить мутации кодирующей области GJB2 гена у глухих детей из республики Дагестан и сравнить их со спектром и общей частотой мутаций у детей с нарушениями слуха, живущих в центре Европейской части РФ.

Материал и методы

В группу испытуемых входили ученики школы-интерната 1-го вида (для глухих детей) г. Махачкалы, имеющих долингвальные (чаще всего врожденные) двусторонние нейросенсорные сильно выраженные нарушения слуха (на уровне тугоухости Ш-IV степени или полной глухоты). Их возраст варьировал от 6 до 16 лет, составляя в среднем 10 лет. Все семьи были проинформированы о ДНК-диагностике, и от родителей были получены письменные согласия. Анамнез и генеалогические данные всех учеников были проанализированы с учетом высокой частоты близкородственных браков и инфекционных болезней в этом регионе. Дети с высокой вероятностью приобретенной глухоты/тугоухости и синдромальных нарушений были исключены из дальнейшего рассмотрения. ДНК-диагностика была проведена для 35 детей из 27 семей с семейными случаями глухоты/тугоухости, родословные которых предполагали аутосомно-рецессивное наследование. Этнический состав группы был смешанным и включал даргинцев, аварцев, лакцев, лезгин и чеченцев.

Анализ мутационного спектра GJB2 гена проводился методом секвенирования. Из высушенных образцов периферической крови (3‒5 капель), приготовленных на фильтровальной бумаге или марлевых салфетках, была выделена ДНК с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep100. Кодирующая область гена GJB2 была амплифицирована с использованием набора праймеров (5´ - cag aga agt ctc cct gtt ctg tcc tag - 3´) и (5´ - cag ctg agc acg ggt tgc ctc atc - 3´). Экзон 1 и примыкающий к нему донорный сайт сплайсинга были амплифицированы с использованием праймеров (5´ - tcc gta act ttc cca gtc tcc gag gga aga g - 3´ или 5´ - cgc act atg cgg agt aca gag gac - 3´) и (5´ - ccc aag gac gtg tgt tgg tcc agc ccc - 3´). Прямое секвенирование амплифицированных областей гена GJB2 было проведено согласно ранее описанным методам [6].

Результаты и их обсуждение

Секвенирование кодирующей области GJB2 гена у 35 дагестанских детей с глубокой врожденной глухотой/тугоухостью АРНСНС типа выявило мутации только у 12 детей (таблица). Общее число выявленных мутаций составило 19. Мутации встречались в гомозиготном (2 случая), в компаунд-гетерозиготном (5 случаев) или в гетерозиготном (5 случаев) состоянии (см. таблицу). Таким образом, общий вклад гена GJB2 во врожденные АРНСНС оказался в Дагестане существенно ниже - не более 34 %, чем в центральных европейских регионах России, где он составил почти 100 % [2].
Мутация 35delG в GJB2 гене была обнаружена у 6 детей, и только у двоих их них в гомозиготном состоянии. Аллельная частота этой мутации среди всех выявленных мутаций в GJB2 гене составила 42 %, что также значительно ниже, чем у детей из центральных европейских регионов России [2]. Кроме этой мутации, в кодирующей области GJB2 гена у двух детей встретилась делеция GAG в положении 355-357 (мутация, известная как ∆E120, приводящая к делеции глутамина в 120 кодоне). Кроме того, была выявлена новая мутация - делеция GAG в положении 559‒561 кодирующей области (мутация ∆E187, приводящая к делеции глутамина в 187 кодоне) и изменение V153I, которое часто относят к полиморфизмам. Оба встретились в гетерозиготном состоянии у одного пациента.

Изменения в кодирующей области GJB2 гена, обнаруженные у дагестанских детей
с врожденными глубокими несиндромальными нарушениями слуха

Примечания:

* ‒ новая мутация в GJB2 гене;

** ‒ это изменение часто относят к полиморфизмам.

Поиск мутаций в донорном месте сплайсинга гена GJB2 на границе экзон1-интрон, там, где ранее была обнаружена редкая для европейской популяции сплайсинговая мутация IVS 1+1 G > A [10] позволил обнаружить эту мутацию у 7 из 35 тестированных детей (см. таблицу). После этого разнообразие выявленных мутаций GJB2 гена в дагестанской популяции достигло пяти (см. таблицу). Мутация IVS 1+1 G > A оказалась среди них настолько же частой, как и мутация 35delG. Аллельная частота этой мутации оказалась равной 37 %. Такая высокая частота этой мутации не описана ни для одной изученной популяции мира.

Мутации не были ограничены отдельными этническими группами. Среди детей с мутацией 35delG были даргинцы (1 человек), аварцы (1 человек), чеченцы (1 человек), азербайджанцы и лезгины (2 человека) и 1 метис, родившийся в браке русская/аварец. С мутацией IVS 1+1 G > A были даргинцы (4 человека), лезгины (1 человек), аварцы (1 человек) и 1 метис.

Таким образом, обнаружены существенные отличия не только в общем вкладе гена GJB2, но и в частоте отдельных мутаций в этом гене у детей с долингвальными НС из республики Дагестан по сравнению с детьми из центральных европейских регионов России. Эти данные следует учитывать при ДНК-диагностике наследственных детских нарушений слуха, которая проводится в первую очередь по гену GJB2 и, часто, только по мутации 35delG [3]. Как оказывается, для дагестанских детей этого недостаточно. Как минимум, требуются секвенирование всей кодирующей области GJB2 гена и анализ донорного сайта сплайсинга.

Можно предположить, что кроме GJB2 гена имеются и другие патологические гены, вызывающие глухоту/тугоухость в этом регионе. Хорошо известно, что в изолированных и/или инбредных популяциях часто создаются благоприятные условия для быстрого размножения редких мутаций от основателя, быстрого достижения ими гомозиготности и проявления в фенотипе. В то время как в обычных популяциях они могут быть с большой вероятностью утеряны. Поэтому наличие в родственных кланах «собственных» мутантных генов не удивительно: один из вариантов мутации мог возникнуть когда-то однократно и благодаря быстрому увеличению численности популяции получить распространение именно в этой этнической группе и затем проявиться фенотипически. Это могут быть, например, гены SLC26A4 или MYO15A, достаточно распространенные в мире [7]. Или же некоторые редкие или пока неизвестные гены, которые представлены только в семьях с близкородственными связями. В любом из этих вариантов необходимы дальнейшие исследования.

Не исключено также, что нарушения слуха в Дагестане могут вызываться редкими мутациями и в других некодирующих областях GJB2 гена, что также требует дальнейшего изучения.

Заключение

Всего методом секвенирования обследовано 35 детей из Дагестана с АРНСНС. Только у 12 детей (34 % от всех детей с АРНСНС) были обнаружены изменения в кодирующей области и в донорном сайте сплайсинга GJB2 гена. Мутации встречались в гомозиготном (2 случая), в компаунд-гетерозиготном (5 случаев) или в гетерозиготном (5 случаев) состоянии. Гетерозиготами оказалось 42 % детей. Таким образом показано, что в республике Дагестан долингвальная несиндромальная аутосомно-рецессивная глухота/тугоухость реже связана с GJB2 геном, чем в центральной европейской части РФ [2].

Основные мутации в GJB2 гене в республике Дагестан представлены тремя типами, характерными также для Передней Азии (не считая одной новой мутации - ∆E187): 35delG (42 % от общего числа мутантных аллелей), IVS 1+1 G > A (37 %) и ∆E120 (10 %). Таким образом мутация 35delG в GJB2 гене, чрезвычайно распространенная в центре европейской части РФ и составляющая там в случае АРНСНС 83 % мутантных аллелей [2], является далеко не самой распространенной патогенной мутацией, вызывающей АРНСНС, в республике Дагестан. Наравне с ней там встречается также сплайсинговая мутация IVS 1+1 G > A.

Эти данные следует учитывать при ДНК-диагностике наследственных НС у дагестанских детей. Требуются дальнейшее изучение мутаций и в других областях GJB2 гена, а также поиск других патологических генов, вызывающих глухоту/тугоухость в этом регионе.

Список литературы

1. Божкова В.П. Наследственные нарушения слуха: роль щелевых контактов (обзор) // Сенсор. сист. - 2008. - Т. 22, № 1. - С. 3-19.
2. Божкова В.П., Хашаев З.Х., Уманская Т.М. Сравнение частоты и мутационного спектра нарушений слуха у детей Дагестана и Европейской части России // Биофизика. - 2010. - Т. 55, Вып. 3. - С. 514-525.
3. Маркова Т.Г., Поляков А.В., Кунельская Н.Л. Клиника нарушений слуха, обусловленных изменениями в гене коннексина 26 // Вестник оторинолар. - 2008. - Т. 2. - С. 4‒9.
4. Худиятова И.М., Хуснутдинова Э.К. Геномная структура и ДНК-диагностика наследственных моногенных заболеваний в Волго-Уральском регионе // Мол. биол. - 2004. - Т. 38. - С. 139‒149.
5. Crynz K., Orzan E., Murgia A. et al. A genotype-phenotype correlation for GJB2 (connexin 26) deafness // J. Med. Genet. - 2004. - Vol. 41. - P. 147‒154.
6. Frei K. Szuhai K. Lucas T. et al. Connexin 26 mutations in cases of sensorineural deafness in eastern Austria // Eur. J. Hum. Gen. - 2002. - Vol. 10. - P. 427-432.
7. Hilgert N., Smith R., Van Camp G. Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: which ones should be analysed in DNA diagnostics? // Mutat. Res. - 2009. - Vol. 68. - P. 189‒196.
8. Mahdieh N., Rabbani B. Statistical study of 35delG mutation of GJB2 gene: a meta-analysis of carrier frequency // Int. J. Audiology. - 2009. - Vol. 48. - P. 363-370.
9. Posukh O., Pallares-Ruiz N., Tadinova V. et al. First molecular searching of deafness in the Altai Republic population // BMC Med. Gen. - 2005. - Vol. 6. - P. 12-19.
10. Snoeckx R.L., Huygen P. L., Feldmann D. et al. GJB2 Mutations and degree of hearing loss: A Multicenter Study // Am. J. Hum. Genet. - 2005. - Vol. 77. - P. 945-957.

Авторы приносят большую благодарность коллективу школы-интерната 1 вида г. Махачкалы (республика Дагестан) за помощь в организации генной диагностики и родителям детей с нарушениями слуха, участвовавших в этом исследовании.

Рецензенты:

Базян А.С., д.б.н., зав. лабораторией нейрохимических механизмов обучения и памяти, Учреждение Российской академии наук, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва;

Шаровская Ю.Ю., д.б.н., ведущий научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва.