Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Выполняемый проект направлен на конструирование и испытание рекомбинантных пробиотических штаммов, позволяющих в пероральной форме доставлять в организм сельскохозяйственных животных белковые продукты пептидные гормоны. Cоматолиберин является одним из наиболее перспективных биоактивных пептидов для пероральной доставки, так как обладает высокой устойчивостью к протеолизу. Кроме того, низкие по сравнению с соматотропином (GH) и инсулиноподобным фактором роста (IGF)действующие концентрации соматолиберина [7] позволяют получать физиологический эффект, несмотря на невысокую эффективность проникновения из просвета кишечника в кровоток. Существуют опубликованные данные о возможности повышения скорости привеса животных за счет перорального введения соматолиберина [7].

Однако практическое применение соматолиберина для создания рекомбинантных пробиотических штаммов, повышающих скорость роста животных, сдерживается недостаточностью знаний о физиологическом действии этого гормона. На различных моделях показано, что максимальная эффективность действия соматолиберина достигается лишь в присутствии агониста - аденилатциклаза-активирующего пептида (PACAP) [4]. В геноме млекопитающих ген PACAP существует независимо от гена соматолиберина (GHRH). Однако у других позвоночных, в том числе птиц, рептилий и рыб, оба гормона синтезируются в виде общего предшественника, который подвергается расщеплению на два пептида в процессе созревания в секреторном аппарате клеток гипофиза [5]. Поскольку в большинстве работ по физиологии соматолиберина использовались химически синтезированные пептиды, до настоящего времени не опубликовано данных об испытаниях физиологического эффекта сочетанного действия GHRH и PACAP. Задача исследования физиологической активности GHRH дополнительно, осложняется наличием у него альтернативных сплайсоформ - продуктов альтернативного сплайсинга первичного транскрипта. В частности, GHRH курицы представлен тремя сплайсоформами, состоящими из 46, 43 и 23 а.о. соответственно [4].

Между тем, задача конструирования гена соматолиберина курицы, оптимального для рекомбинантной экспрессии в клетках пробиотиков, ставит вопрос о целесообразности сохранения или удаления той части природной последовательности ДНК, которая кодирует пептид PACAP.

Целью настоящей работы являлось создание производных гена соматолиберина курицы, кодирующих зрелую последовательность GHRH («длинная» сплайсоформа, состоящая из 46 а.о.) и PACAP, на основе которых были созданы конструкции, обеспечивающие экспрессию в клетках E. coli. Биомасса этих штаммов порознь и в смеси друг с другом исследовалась на способность ускорять рост модельных животных.

Материалы и методы исследования

Было получено и испытано 8 штаммов E. coli. Штаммы получены путем введения четырех экспрессионных конструкций, включая интактный вектор pQE30, (табл. 1) в два различных базовых штамма E. coli - C41(DE3) и TG1.

Таблица 1

Экспрессионные конструкции, предназначенные для продукции производных
соматолиберина свиньи и курицы, в клетках E. coli

Штаммы селектировали в момент проведения трансформации и в дальнейшем поддерживали на чашках Петри с агаризованной средой или жидкой среде LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 37 °С. При поддержании на плотной среде пересев проводится не реже 1 раза в неделю. Для получения биомассы штаммы культивировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 50 мл среды, в течение 14‒16 часов при интенсивной аэрации (≥ 250 rpm). Полученную таким образом биомассу собирали низкоскоростным центрифугированием, промывали физиологическим раствором (150 мМ NaCl) и суспендировали в минимальном объеме физиологического раствора с целью создания концентрации бактериальных клеток не ниже 1010 КОЕ/мл.

Биологические испытания проводились на белых беспородных мышах возрастом 3‒4 недели. Мыши содержались на полноценном белково-витаминном корме в условиях, обеспечивающих максимальную скорость роста. Испытуемый препарат пробиотического штамма вносился в корм 1 раз в сутки в течение всего времени проведения испытаний - 20 дней.

Для проведения испытаний каждого штамма выделялась выборка из 40 мышат возрастом 4 недели, которая разбивалась на две подвыборки. Подвыборка 1 получала 107 КОЕ в сутки, подвыборка 2 - 106 КОЕ в сутки. В качестве контрольной группы выступала выборка из 20 мышей, не получающая пробиотика.

Взвешивание каждой выборки животных проводилось ежедневно в одно и то же время (вся выборка одновременно). Общая длительность эксперимента составила 21 день.

Результаты исследования и их обсуждение

Получение экспрессионных конструкций.

С помощью ПЦР из генома курицы было клонировано два экзона гена соматолиберина, которые затем были слиты и введены в состав вектора pQE30. В качестве источника гена была выбрана геномная ДНК курицы, выделенная из мышечной ткани методом фенольной экстракции как описано ранее [3, 6]. Основываясь на известной интрон-экзонной организации гена соматолиберина курицы (рис. 1) [4], были сконструированы две пары праймеров SLN1-SLN2 и SLN3-SLN4. Праймеры позволяли получить ген соматолиберина, кодирующий полноразмерный зрелый гормон без пропептида и секреторного лидера, соответствующий сплайсоформе I первичного транскрипта («длинная» сплайсоформа, состоящая из 46 а.о.).

Рис. 1. Экзонная организация гена соматолиберина в геноме курицы Gallus gallus по [4] и стратегия получения полусинтетического искусственного гена с помощью ПЦР. Последовательности экзонов сплайсоформы I выделены серым

С помощью пары праймеров SLN1 + SLN2 на матрице геномной ДНК курицы бы получен размер продукта 103 п.н., соответствующий II экзону гена соматолиберина, а с помощью пары праймеров SLN3 + SLN4 - продукт размером 238 п.н., соответствующий III экзону того же гена. На 5´-конец праймера SLN3 была введена последовательность из 20 нуклеотидов, комплементарная праймеру SLN2, что позволяло продуктам ПЦР, полученным с использованием праймеров SLN2 и SLN3, взаимно отжигаться друг с другом. Кроме того, в составе праймеров SLN2 и SLN3 была введена транзиция C/T, не вызывающая аминокислотных замен, но позволяющая уничтожить сайт рестриктазы BalI (TGGCCA).

Продукты ПЦР были очищены элюцией из агарозного геля, объединены и использованы в качеcтве матрицы для проведения ПЦР с праймерами SLN1 + SLN4. В результате был получен продукт размером 321 п.н.. После элюции из агарозного геля он был обработан рестриктазами BamHI и SalI и клонирован в вектор pQE30 (Qiagen), предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге была отобрана конструкция pQE-SLN1, содержащая ген полноразмерного зрелого соматолиберина.

Эта конструкция послужила в качестве исходной для получения искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина - пептиды GHRH и PACAP. С этой целью на матрице pQE-SLN1 был проведен ПЦР с праймерами SLN1/SLN102 (размер продукта 156 п.н.) и праймерами SLN101/SLN4 (размер продукта 179 п.н.). После элюции из агарозного геля эти продукты были обработаны рестриктазами BamHI и SalI и клонированы в вектор pQE30 (Qiagen), предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге были отобраны конструкции pQE-SLN-Ch1, содержащая ген пептида GHRH (рис. 2), и pQE-SLN-PACAP, содержащая ген пептида PACAP (рис. 3).

Рис. 2. Последовательность гена пептидного гормона GHRH соматолиберина курицы в составе конструкции pQE-SLN-Ch1. Рамками показаны сайты клонирования BamHI и SalI, серым - нуклеотиды кДНК пептида GHRH, жирным-подчеркнутым шрифтом -
стартовый и стоп-кодоны искусственного гена. В составе олигонуклеотидных
праймеров прописными буквами показаны нуклеотиды, соответствующие
последовательности гена соматолиберина, строчными - дополнительные нуклеотиды, необходимые для введения сайтов клонирования

Наряду с генами производных соматолиберина курицы в рамках проекта был синтезирован ген GHRH свиньи. Его использование наряду с генами курицы облегчает проведение биологических испытаний рекомбинантных штаммов-пробиотиков на животных моделях благодаря возможности парного сравнения эффектов штаммов с различными вариантами пептидных гормонов.

До настоящего времени в литературе не опубликована последовательность кДНК или геномного гена соматолиберина свиньи. Но в работе [1] методом секвенирования пептидов по Эдману была установлена последовательность зрелого GHRH этого млекопитающего. Сопоставление данных работы [1] с последовательностью геномного гена соматолиберина человека [2] позволило установить полную идентичность их белковых продуктов. Таким образом, экспрессия ген человеческого происхождения обеспечивала возможность синтеза GHRH свиньи.

Рис. 3. Последовательность гена пептидного гормона PACAP соматолиберина курицы
в составе конструкции pQE-SLN-PACAP. Рамками показаны сайты клонирования BamHI и SalI, серым - нуклеотиды кДНК пептида PACAP, жирным-подчеркнутым шрифтом -
стартовый и стоп-кодоны искусственного гена. В составе олигонуклеотидных
праймеров прописными буквами показаны нуклеотиды, соответствующие
последовательности гена соматолиберина, строчными - дополнительные нуклеотиды, необходимые для введения сайтов клонирования

С этой целью на матрице геномной ДНК человека был проведен ПЦР с праймерами SLN-Н1 и SLN-Н2, в результате чего образовался продукт размером 112 п.н.. После элюции из агарозного геля продукт ПЦР был обработан рестриктазами BamHI и SalI и клонирован в вектор pQE30 (Qiagen), предварительно расщепленный по сайтам BamHI и SalI. В итоге была получена конструкция pQE-SLN-Le1, содержащая ген пептида GHRH свиньи (рис. 4).

Рис. 4. Последовательность гена пептидного гормона GHRH соматолиберина свиньи в составе конструкции pQE-SLN-Le1. Рамками показаны сайты клонирования BamHI и SalI, серым - нуклеотиды кДНК пептида GHRH, жирным-подчеркнутым шрифтом -
стартовый и стоп-кодоны искусственного гена. В составе олигонуклеотидных
праймеров прописными буквами показаны нуклеотиды, соответствующие
последовательности гена соматолиберина, строчными - дополнительные нуклеотиды, необходимые для введения сайтов клонирования

Полученные конструкции pQE-SLN-Ch1, pQE-SLN-PACAP и pQE-SLN-Le1 были использованы для экспрессии в лабораторных условиях с целью препаративной наработки соматолиберина в виде биомассы E. coli.

Биологические испытания рекомбинантных пробиотических штаммов E. coli

Результаты эксперимента по биологическому тестированию представлены в табл. 2.

Полученные результаты свидетельствуют о негативном влиянии реципиентного штамма TG1 на выживаемость и скорость привеса экспериментальных животных. Этот эффект наблюдается и в случае контрольного штамма, несущего нерекомбинантный вектор pQE30. В связи с этим результаты о свойствах конструкций, полученные на модели штамма TG1, нельзя считать достоверными.

Напротив, штамм E. coli C41(DE3) сам по себе не оказывал существенного влияния на скорость роста мышей в пределах использованных концентраций клеток модельного пробиотика (10⁶-10⁷ кое в сутки). Среди испытанных конструкций, введенных в штамм C41(DE3), наибольший положительный эффект проявила конструкция pQE-SLN-Ch1, несущая ген «длинной» сплайсоформы 1 GHRH курицы. Эффект имел дозовую зависимость: при нагрузке 106 скорость привеса увеличивалась на 9,5 %, а при нагрузке 10⁷ кое в сутки - на 15,1 % по сравнению с контролем. При этом разброс результатов в контрольных выборках не превышал 5 %. При этом штаммы, несущие ген PACAP, а также ген GHRH свиньи достоверно не отличались по влиянию на скорость привеса мышей от контрольного штамма с нерекомбинантным вектором pQE30.

Таблица 2

Результаты тестирования влияния перорального введения биомассы штаммов E. coli,
несущих экспрессионные конструкции с генами соматолиберина свиньи и курицы,
на скорость прироста массы мышат

В столбцах дано название реципиентного штамма, несущего конструкции, и суточная дозировка рекомбинантного пробиотического штамма в расчете на одно животное. В ячейках таблицы дана суммарная масса выборки мышей на 21-й день эксперимента.

¹ Два животных из выборки погибло на 11 и 14 день эксперимента. Масса выборки рассчитана путем экстраполяции массы выживших животных на исходный состав выборки.

² Три животных из выборки погибло на 12, 13 и 15 день эксперимента. Масса выборки рассчитана путем экстраполяции массы выживших животных на исходный состав выборки.

Заключение

Полученные результаты убедительно свидетельствует о возможности пероральной доставки пептидного гормона GHRH животным. При этом модель мышат обладает необходимой чувствительностью для изучения количественных и качественных характеристик соматолиберина курицы.

Список литературы

1. Bohlen P. Isolation and characterization of the porcine hypothalamic growth hormone releasing factor / P. Bohlen, F. Esch, P. Brazeau, N. Ling and R. Guillemin // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1983. - Vol. 116, № 2. - P. 726-734.
2. Cravador A. Total DNA synthesis and cloning in Escherichia coli of a gene coding for the human growth hormone releasing factor / A. Cravador, P. Jacobs, A. Van Elsen, C. Lacroix, B. Colau, P. Van Alphen, A. Herzog and A. Bollen // Biochimie - 1985. - Vol. 67, № 7-8. - P. 829-834.
3. Iwasaki Y. Characterization of the putative alpha subunit of a heterotrimeric G protein in rice / Iwasaki Y., Kato T., Kaidoh T., Ishikawa A., Asahi T. // Plant Mol. Biol. - 1997. - №4. - P. 563-72.
4. McRory G.E. Expression and Alternative Processing of a Chicken Gene Encoding Both Growth Hormone-Releasing Hormone and Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide / G.E. McRory, R.L. Parker, N.M. Sherwood // DNA AND CELL BIOLOGY. - 1997. - Vol. 16, №1. - P. 95-102.
5. Montero M. Molecular evolution of the growth hormone-releasing hormone/pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide gene family. Functional implication in the regulation of growth hormone secretion / M. Montero, L. Yon, S. Kikuyama, S. Dufour and H. Vaudry // Journal of Molecular Endocrinology. - 2000. - Vol. 25. -P. 157-168
6. Sambrook J. Molecular cloning / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis - Cold Spring Harbor Laboratory press. - New York, 1989.
7. Wang Y. Identification of the endogenous ligands for chicken growth hormone-releasing hormone (GHRH) receptor: evidence for a separate gene encoding GHRH in submammalian vertebrates / Y. Wang, J. Li, C.Y. Wang, A.H. Kwok and F.C. Leung // Endocrinology. - 2007. - Vol. 148, № 5. - P. 2405-2416.

Рецензенты:

Фаизов Тагир Хадиевич, д.б.н., зав. лабораторией молекулярно-генетического анализа ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиологической безопасности животных» Казань;

Ляпустин Виктор Николаевич, д.б.н., с.н.с., в.н.с. лаборатории молекулярной биологии, ИПВЭ им.М.П. Чумакова РАМН.