Введение. Методология определения токсикометрических характеристик пестицидов длительна по времени и представляет собой трудоемкий процесс [3, 4]. В связи с этим актуальным становится совершенствование существующих на сегодняшний день биотестовых методов до методов измерительного уровня, используя при этом в качестве чувствительных элементов биологические объекты [6]. Данная система применима для оценки биологической активности и токсичности пестицидов. Ключевая роль при этом отводится поиску оптимального физиологического параметра тест-объекта, который позволял бы в короткие сроки прогнозировать воздействие химических веществ на живые организмы [1, 2]. В связи с этим целью исследования явилось обоснование выбора биопараметра частоты сердечных сокращений как наиболее оптимального и показательного для оценки действия химических веществ с помощью классического объекта водной токсикологии Daphnia magna.
Материалы и методы
Исследование проводилось по модифицированной методике, предложенной А.Д. Усановым [5]. Данная методика предназначена для определения частоты сердцебиения Daphnia magna в условиях токсического воздействия пестицидов и установления зависимости данного физиологического параметра тест-объекта от концентрации токсикантов. Исследования проводились на молоди, полученной от одной самки на модифицированной экспериментальной установке (рис. 1).
Рис. 1. Схема установки:
1 - источник света; 2 - линза; 3 - особь Daphnia magna; 4 - камера для Daphnia magna; 5 - столик: 6 - объектив микроскопа; 7 - видеоокуляр; 8 - компьютер
Программная часть системы содержит специализированную программу Windows Movie Maker, позволяющую анализировать введенное в компьютер видеоизображение колеблющегося сердца Daphnia magna и осуществляющую автоматический подсчет частоты сердцебиений Daphnia magna.
Эксперимент проводили на свежеприготовленных растворах пестицидов различной концентрации - от летальной до витальной. Особей переносили пипеткой в каплю воды в специальную камеру, зафиксированную на предметном стекле. Оценка результатов эксперимента по влиянию растворов исследуемых веществ различной концентрации на сердечный ритм Daphnia magna проводилась на основании средних величин из 5 параллельных опытов и контролей, рассчитанных на 10 особей. Продолжительность подсчета средних показателей осуществлялась в экспозиции 10 минут каждых 6-12 часов в течение 2 суток.
Исследуемые пестициды являются микробиологическими препаратами для защиты растений: «Фитоспорин-М» (д.в. являются живые клетки и споры природной бактериальной культуры Bacillus subtilis.); «Фитоверм» (0,2 %-й эмульгирующийся концентрат аверсектина, продуцируемого почвенными микроорганизмами Streptomyces avermectilis); «Лепидоцид» (действующей основой является кристаллообразующая бактерия Bacillus thuringiensis var. kurstaki, активным ингредиентом ‒ споро-кристаллический комплекс).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты определения влияния микробиологического пестицида «Лепидоцид» на сердцебиение Daphnia magna представлены на рис. 2. Эксперимент показал, что при помещении особей Daphnia magna в растворы исследуемого пестицида летальных концентраций частота сердцебиений в начальный период экспозиции составляла в среднем 290,0 ± 1,6 - 262,3 ± 1,8 ударов в минуту и таким образом была достоверно выше контроля на 19,12‒31,95 %. Витальные концентрации вызывали незначительное повышение частоты, а через некоторое время адаптации к токсиканту практически не отличались от контрольных значений.
Процесс угнетения сердечной деятельности Daphnia magna под действием токсичных растворов пестицидов изучен с построением математических моделей криволинейной зависимости, описанной аналитически соответствующими корреляционными уравнениями, частоты сердцебиений от концентрации исследуемых препаратов.
Рис. 2. Зависимость распределения частоты сердечных сокращений Daphnia magna
от концентрации микробиологического пестицида «Лепидоцид»
Аппроксимируя экспериментальные средние данные изменения частот сердцебиения во времени в условиях влияния летальных концентраций препарата «Лепидоцид», получена зависимость, представленная следующим образом:
где а = 190,61, b = 59,84, c = 14,78, d = -12,05, е = 45,83; r2 = 0,97, Fst= 92,64.
При достижении Daphnia magna максимального значения частоты сердечных сокращений начинается IV фаза токсикологического процесса - глубокое угнетение жизнедеятельности особей (сердечной функции и дыхания). В данном случае это локальный экстремум аппроксимирующей функции, приравненный к нулю:
С этого момента наступает необратимая фаза патологии жизнедеятельности особей Daphnia magna, которая четко прослеживается на графике линейной зависимости частоты сердцебиений от времени экспозиции в летальных концентрациях исследуемых пестицидов.
При экспозиции Daphnia magna в растворах летальных концентраций микробиологического препарата «Фитоверм» отмечено, что частота сердцебиений особей достоверно превышает контрольные показатели на 32,0-48,0 %. В диапазоне концентраций 0,0001-0,000001 мл/л экспериментальные показатели на всем протяжении опыта незначительно отличались от контрольных. Характер изменения средних частот сердцебиений Daphnia magna в течение 6-часовой экспозиции «Фитоверма» представлен на рис. 4.
Частота сердцебиений в первый период эксперимента для летальных концентраций варьировала от 326,8 ± 2,1 до 270,6 ± 1,9. Снижение показателей наблюдалось уже через 3-4 часа и составляло 76,5-85,8 % от исходных.
Рис. 3. Влияние летальных концентраций биологического препарата «Лепидоцид»
на сердечную функцию Daphnia magna во времени (48 часов)
Рис. 4. Зависимость распределения частоты сердечных сокращений Daphnia magna
от концентрации биологического пестицида «Фитоверм»
Аппроксимируя экспериментальные данные средних частот сердцебиения Daphnia magna во времени под влиянием летальных концентраций препарата «Фитоверм», получена следующая зависимость:
где а = -787,09, b = 828,06, c = -219,82, d = -51,26, e = 1060,49; r2 = 0,98, Fst = 250,8.
Максимальное значение частоты сердечных сокращений Daphnia magna в экспозиции пестицида «Фитоверм» определяется следующим образом:
На рис. 5 представлена линейная зависимость частоты сердцебиений от времени экспозиции в летальных концентрациях биологического пестицида «Фитоверм».
Рис. 5. Влияние летальных концентраций микробиологического препарата «Фитоверм» на сердечную функцию Daphnia magna во времени (48 часов)
Анализ результатов сердцебиений Daphnia magna под влиянием биопрепарата «Фитоспорин-М» представлен на рис. 6. При помещении особей в растворы летальных концентраций исследуемого пестицида частота сердцебиений в начальный период экспозиции составляла в среднем 280,54 ± 1,5 - 252,3 ± 1,7 ударов в минуту и таким образом была достоверно выше контроля на 14,26-27,05 %. Витальные концентрации препарата вызывали незначительное повышение частоты, а через 6 часов экспозиции практически не отличались от контрольных показаний.
Рис. 6. Зависимость распределения частоты сердечных сокращений Daphnia magna от концентрации биологического пестицида «Фитоспорин-М»
Аппроксимация экспериментальных данных усредненных частот сердцебиения во времени в условиях влияния летальных концентраций препарата «Фитоспорин-М» позволила получить аналогичную зависимость:
где а = 286,14, b = 7,97, c = 24,6, d = -13,97; r2 = 0,98, Fst = 157,36.
Максимальное значение частоты сердечных сокращений Daphnia magna, указывающее на необратимые функциональные изменения в организме тест-объекта, в условиях влияния пестицида «Фитоспорин-М», определяется следующим образом:
На рис. 7 представлена линейная зависимость частоты сердцебиений от времени экспозиции в летальных концентрациях биологического пестицида «Фитоспорин-М».
Рис. 7. Влияние летальных концентраций биологического препарата «Фитоспорин-М»
на сердечную функцию Daphnia magna во времени (48 часов)
Выводы. Установлено, что зависимость частоты сердечных сокращений Daphnia magna от концентраций исследованных препаратов имеет вид кривой, описываемой функциями типа 
и 
. Витальные же концентрации незначительно изменяют характер сердцебиения на первом этапе экспозиции, возвращая значения в состояние нормы путем адаптации к токсичной среде.
Достижение максимального значения частоты сердечных сокращений Daphnia magna, определяемое дифференциалом указанных функций, может служить маркером угнетения сердечной деятельности и, как следствие, сигналом к гибели популяции Daphnia magnа, что можно рассматривать как возможность установления предельно допустимых концентраций смесевых веществ.
Обнаруженная зависимость позволяет расчетным способом определять характер биоцидного действия пестицидов п.ф. на сердечную деятельность Daphnia magna, что может быть использовано как функциональный экспресс-тест. Эта же зависимость может быть использована для создания автоматизированной тест-системы контроля качества воды, основанной на оптическом методе регистрации частоты биоритмов водных организмов.
Использование зависимости частоты сердечных сокращений от концентрации как наиболее оптимального параметра для оценки действия пестицидов позволит правильно спланировать эксперимент, обоснованно выбирать концентрации веществ для постановки токсикологических опытов, уменьшая при этом их стоимость и сводя к минимуму вероятность ошибки ввиду использования оптического метода и новейших цифровых технологий. Аппроксимация количественных зависимостей «частота сердечных сокращений - концентрация химических веществ» может стать альтернативным методом установления предельно допустимых концентраций пестицидов препаративной формы или смесевых веществ.
Список литературы
- Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna S. и других ветвистоусых ракообразных // Гидробиологический журнал. - 2000. - Т.36, №5. - С. 50‒70.
- Козлов А.Т, Тушманова Н.А. Структура и механизмы поведения беспозвоночных. - Воронеж: Квадрат, 1995. - 280 с.
- Колупаев Б.И., Андреев А.А., Самойленко Ю.А. Оптический метод регистрации сердечного ритма у дафний // Гидробиологический журнал. - 1977. - 13, №3. - С. 93-94
- Частота сердечных сокращений у Daphnia magna как функциональный тест оценки действия химических соединений / Н.П. Подосиновикова, Н.Ф. Ежов, Н.А. Сайкина, В.А. Беляев, В.Б. Долго-Сабуров // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 73, № 3. - С. 54-56.
- Усанов А.Д. Исследование влияния переменного магнитного и электрического полей на живые организмы и водную среду с использованием дафнии в качестве биоиндикатора: дис. ... канд. физ.-мат. наук. - Саратов, 2004. - 103 л.
- Cairns J.Jr. Restoration Ecology and Ecotoxicology // Handbook of Ecotoxicology / J.Jr. Cairns. - N.Y.: Levis publishers Ltd, 2005. - P. 1015-1029.
Рецензенты:
Благовещенская Нина Васильевна, д.б.н., доцент, директор Ульяновского областного детского экологического центра;
Назаренко Людмила Дмитриевна, д.п.н., профессор, зав. кафедрой анатомии, физиологии и гигиены человека Ульяновского государственного педагогического университета
им. И.Н. Ульянова.