Повышенный интерес к глюкоамилазе обусловлен широким применением данного фермента в медицине, пищевой и легкой промышленности в качестве эффективного биокатализатора. Корректное исследование механизма действия фермента подразумевает наряду с определением функциональных свойств проведение структурного анализа. Сравнение первичных структур глюкоамилаз из различных источников позволит идентифицировать аминокислотные остатки, играющие важнейшую роль в функционировании данных ферментов.
Для выявления константных областей аминокислотных последовательностей ферментов узкой группы с помощью программы GeneBee (http://www.genebee.msu.ru/genebee.html) осуществлено сравнение сиквенсов субъединиц глюкоамилаз из микромицетов рода Aspergillus: Asp. niger, Asp. awamori X100, Asp. awamorivar. kawachi, Asp. shirousami, Asp.oryzae, размещенных в INTERNET National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez) и Protein Brookhaven Data base(http://www.rcsb.org). Обнаружено, что первичные структуры рассматриваемых белковых молекул гомологичны друг другу на 86,1%. Сигнальные пептиды в высокой степени схожи и состоят из 24 аминокислотных звеньев. Однако данный фрагмент пробелка изAsp.oryzaeхарактеризуется наличием двух дополнительных остатковVal-2 иVal-20. Показано, чтоN-концевыми аминокислотами полипептидных цепей являются остатки Ala и Thr; C-концевыми -Trp и Arg. Наиболее протяженные, абсолютно идентичные для анализируемых сиквенсов фрагменты, их позиции в первичной структуре и наличие функционально значимых аминокислотных остатков представлены в табл. 1.
Из табл. 1 видно, что в состав константных областей полипептидных цепей глюкоамилаз рода Aspergillus входят остатки Asp и Glu, карбоксильные группы которых участвуют в разрыве гликозидных связей в молекуле крахмала в процессе катализа, и остаток Trp, выполняющий субстрат-связывающую функцию [1, 3].
Сопоставление первичных структур глюкоамилаз Asp. species показало, что частота замен остатков на протяжении полипептидных цепей отличается высокой вариабельностью. В результате сравнения сиквенсов этих ферментов удалось выявить несущественные для проявления структурно-функциональных свойств белков позиции аминокислот, обнаружив высокую частоту замен звеньев в данных местах полипептидных цепей (табл. 2). Более эволюционно значимыми событиями являются вставки и пропуски отдельных остатков или целых групп аминокислот. Так, полипептидная цепь субъединицы глюкоамилазы из Asp. oryzae, наряду с приобретением дополнительного остатка Gly-3 утратила три довольно протяженных фрагмента, а также Ser-584, в результате чего существенно укоротилась и состоит из 586 аминокислотных звеньев. Анализ имеющихся данных [2, 4-6] показал, что делеции затрагивают только О-гликози-лированный домен белковой глобулы и не отражаются на функциональных свойствах фермента. Обнаружено, что в аминокислотных последовательностях субъединиц глюкоамилаз из Asp. oryzae, Asp. awamori X 100,Asp. awamori var. kawachi, Asp. shirousami имеет место пропуск Ala-102 в каталитическом домене. В результате делеции остатка Ala-102, несущественного для проявления ферментативной активности, их полипетидные цепи включают 615 мономерных звеньев.
Таблица 1
Консервативные области полипептидных цепей глюкоамилаз рода Aspergillus
| Фрагмент полипептидной цепи | Позиция фрагмента | Наличие |
| PDYFYTWTRDSG | 46-571,2 , 47-583 | D-551,2, D-563 |
| GLGEPKFNVDETA | 103-1151,3 , 102-1142 | - |
| WGRPQRDGPALRATAMI | 120-1361,3 , 119-1352 | W-1201,3, W-1192 |
| VRNDLSYVAQYW | 159-1701,3 , 158-1692 | - |
| PLWEEV | 176-1811,3, 175-1802 | E-1791,3, E-1782 |
| TLAAAEQLYDALYQWDK | 321-3371,3, 320-3362 | - |
| SARDLTWSYAALLTANNRRN | 411-4301, 410-4292 | - |
Таблица 2
Структурная вариабельность полипептидных цепей субъединиц глюкоамилаз рода Aspergillus
| Продуцент глюкоамилазы | Позиции остатков с высокой частотой замен |
| Aspergillus niger | 60, 73, 80, 84, 88, 91, 130, 150, 219, 232, 240, 246, 261, 310, 320, 343, 357, 375, 399, 403, 409, 410, 436, 446, 456. 482, 487, 496, 504, 551, 583 |
| Aspergillus awamori X 100, Aspergillus awamori var. kawachi, Aspergillus shirousami | 60, 73, 80, 84, 88, 91, 129, 149, 218, 231, 239, 245, 260, 309, 319, 342, 356, 374, 398, 402, 408, 409, 435, 445, 455, 481, 486. 495, 503, 550, 582 |
| Aspergillus oryzae | 61, 74, 81, 85, 89, 92, 130, 150, 219, 232, 240, 246, 261, 310, 343, 357, 375, 399, 403, 409, 410, 436, 446, 456, 483, 529, 551, 576 |
Известно, что дисульфидные мостики обнаруживают тенденцию сохраняться в процессе эволюции, поэтому они присутствуют в одних и тех же участках третичной структуры родственных белков [2, 4-6].
Установлено, что 8 остатков Cys, участвующих в образовании дисульфидных мостиков, в анализируемых сиквенсах глюкоамилаз занимают жестко фиксированные позиции и входят в состав абсолютно идентичных участков цепи. Остатки Cys-319 и Cys-320 в полипептидных цепях глюкоамилаз из Asp. niger, Asp. awamori X 100, Asp. shirousami представлены свободными SH-группами и характеризуются высокой частотой замен.
В результате проведенного анализа аминокислотных последовательностей глюкоамилаз рода Aspergillus установлена высокая степень гомологичности для ферментов из Asp. awamori X 100 иAsp. shirousami; самые существенные отличия обнаружены между амилазами из Asp. awamori X 100 и Asp. oryzae. Выявлено, что в состав константных областей полипептидных цепей глюкоамилазAspergillus species входят остатки Asp, Glu и Trp,что позволяет подтвердить их участие в осуществлении катализа реакции гидролиза крахмала.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. – Киев: Наук. думка, 1987. – 192 с.
2. Кантор Ч. Биофизическая химия. – М.: Мир, 1984. – Т. 1. – 336 с.
3. Квеситадзе Г.И. Грибные и бактериальные амилазы. – Тбилиси: Мецниереба, 1984. – 154 с.
4. Попов Е.М. Структурно-функцио-нальная организация белков. – М.: Наука, 1992. – 358 с.
5. Шерман С.А. Конформационный анализ и установление пространственной структуры белковых молекул. – Минск: Наука и техника, 1989. – 240 с.
6. Шульц Г. Принципы структурной организации белков. – М.: Мир, 1982. – 360 с.