Кислород является обязательным и необходимым элементом для многочисленных биохимических реакций, протекающих в важных метаболических путях клетки. При недостаточности кислорода нарушается скорость метаболических реакций в организме, что приводит к нарушению функции клеток и органов. Roubin [6] нарушение утилизации О2 клетками обозначает термином «дизоксия». Автор различает три вида дизоксии: 1) гипоксическая дизоксия, возникающая при снижении количества поступающего в ткани О2, т. е. пониженное снабжение или транспорт О2; 2) нормоксическая дизоксия, при которой снабжение и транспорт О2 нормальный, но нарушается утилизация О2 на уровне субклеточных органелл (митохондрии, микросомы, пероксисомы, лизосомы, ядро и др. органеллы); 3) гипероксическая дизоксия – нарушение функции клетки при повышенном содержании О2 или повышенной его активности (свободно-радикальные повреждения, нарушение разложения Н2О2 – перекисные повреждения и др.).
Кислородная недостаточность, возникающая при чумной интоксикации, связана с нарушением метаболических и гуморально- метаболических факторов регуляции.
Патологические состояния, возникающие в организме при кислородном голодании, проявляются на различных уровнях: на уровне целостного организма, различных органов и систем, клеточном, субклеточных фракций, молекулярном.
Среди молекулярных клеточных изменений основное место занимают нарушения процессов энергообразования и поражения клеточных мембран.
Одним из индикаторов структурно-функционального состояния плазматических мембран является АТФ-аза.
Повсеместно встречающийся в плазматической мембране (Na+ + K+) – насос – это АТФ-аза. Натриево-калиевые насосы, имеющиеся в плазматических мембранах всех животных клеток, работают по принципу антипорта, активно качая Na+ из клетки, а K+ – в клетку против градиентов концентраций (в случае же ионов Na+ и против электрического градиента). Избирательная проницаемость биологических мембран по отношению к простым ионам создает значительные различия в ионном составе внутреннего содержимого клетки и внеклеточной жидкости. Так, внутриклеточная концентрация (мМ) Na+ – 5–15, K+ – 140, Mg2+ – 30, Са2+ – 1–2, внеклеточная концентрация – 145, 5, 1–2 и 2,5–5 соответственно.
Градиенты концентраций ионов Na+ и K+, поддерживаемые натриево-калиевым насосом, ответственны не только за мембранный потенциал клетки, но и за регуляцию клеточного объема, а также за активный транспорт сахаров и аминокислот.
Кроме того, Na, K АТФ-аза осуществляют контроль за дыханием, регуляцию внутриклеточного значения рН и трансмембранного переноса сахаров, аминокислот, нейротрансмиттеров.
Важная роль (Na+ + K+) АТФ-азы в регуляции клеточного объема подтверждается тем фактом, что при обработке животных клеток уабаином (С1-строфантин), ингибирующим (Na+ + K+) АТФ-азу, они разбухают и разрываются. Следует отметить, что в большинстве животных клеток основная роль в предотвращении разрыва из-за осмотического давления принадлежит (Na+ + K+) АТФ-азе.
Значительный шаг в понимании молекулярного механизма натриево-калиевого насоса был сделан в 1957 году, когда обнаружилось, что для оптимальной активности фермента, гидролизующего АТФ до АДФ и фосфата, требуются Na+ + K+.
Однако в плазматических мембранах эукариотических клеток обнаруживаются ферменты, действующие в обратном направлении: вместо гидролиза АТФ, обеспечивающего транспорт ионов (как в случае (Na+ + K+) АТФ-азы и Са 2+ – АТФ-азы), они катализируют синтез АТФ из АДФ и фосфата. Поэтому такие ферменты называются АТФ-синтетазами. Во всех случаях ферменты могут работать в обоих направлениях в зависимости от условий: они могут гидролизовать АТФ и качать Н+ через мембрану во внутреннее пространство или же могут синтезировать АТФ при прохождении потока ионов Н+ через молекулы ферментов в обратном направлении.
В литературе отсутствуют данные о механизмах регуляции активности данного фермента при экстремальных воздействиях.
Цель данной работы заключалась в изучении активности АТФ-азы клеток экспериментальных животных при воздействии «мышиного» токсина (МТ) чумного микроба.
Материалы и методы: изучение активности АТФ-азы проводили на спленоцитах монгольских песчанок (целых и мембранных фракций клеток). Селезенки забирали у декапитированных животных и освобождали от эритроцитов промыванием 0,84 % раствором NH4Cl на холоде. Для выделения мембранных фракций клетки разрушали при 4 оС на ультразвуковом дезинтеграторе PY-100 MSE 150W (Англия) с помощью цилиндрического стержня 9,5 мм при частоте колебаний 20 кГц и амплитуде 10–12 мкм. Время озвучивания составило 3 мин. Клеточные фракции выделяли методом дифференциального центрифугирования. Полученные мембранные фракции исследовались на содержание белков, обладающих АТФ-азной активностью.
Пробы содержали: 25 мМ трис-HCl буфер; рН 7,4; 100 мМ KCL; 65 мМ NaCl; 5 мМ MgCl2 и 0,1 М АТФ. Активность измеряли в мкМ Рн на мг белка. Фосфор определяли по Фиске и Суборроу [3], белок – по Лоури [5] и методом дифференциальной спектрометрии [4].
Количество АТФ измеряли хемилюминесцентным методом с помощью стандартного набора фирмы Calbiochem (США).
Изменение АТФ-синтетазной активности мембранных фракций спленоцитов монгольских песчанок в наших экспериментах определяли параллельно двумя методами [2]. В одних опытах использовали рН-индикатор феноловый красный (30 мкМ), в других – синтетазную активность определяли в присутствии АТФ-регенирирующей системы.
Показания электролитного состава крови: Na+ К+ Са++ и Cl- получены нами на газовом анализаторе кислотно-щелочного равновесия Ciba – Korning 860 (Англия).
За 18–20 часов до получения крови животным вводили 0,5 мл «мышиного» токсина (0,5–1 мкг), контрольным – по 0,5 мл физиологического раствора. МТ получен из штамма кишечной палочки DН5α, несущей рекомбинантную плазмиду с клонированным геном токсина. Молекулярная масса токсина, по данным электрофореза, составила 61 кД, Ld50 очищенного препарата составляла для белых мышей 1,0–1,2 мкг по белку.
Результаты и обсуждение
При определении электролитного состава крови у экспериментальных животных установлено, что содержание ионов Na+ при введении «мышиного» токсина чумного микроба 0,5–1 мкг имеет тенденцию к увеличению, а К+ увеличивается в 2,05, 1,4 1,06 у белых мышей, монгольских песчанок и морских свинок соответственно (таблица 1).
Таблица 1
Содержание электролитов крови животных под влиянием «мышиного» токсина чумного микроба (мг/%)
| Вид животных | «Мышиный» токсин чумного микроба М±м | ||||
| Na+ | К+ | Са++ | Cl- | ||
| Белые мыши n=12 | К | 137,5±14,6 | 5,2±0,6 | 0,97±0,085 | 105±9,4 |
| О | 138,2±13,8 | 10,7±1,2 | 0,61±0,07 | 87±9,2 | |
| Монгольские песчанки n=7 | К | 119,3±10,9 | 4,2±0,38 | 1,37±0,28 | 118±11,7 |
| О | 128,9±12,4 | 6,03±0,7 | 1,09±0,09 | 94±10,1 | |
| Морские свинки n=7 | К | 134,7±13,7 | 5,8±0,64 | 1,20±0,12 | 97±9,3 |
| О | 136,8±14,1 | 6,2±0,66 | 1,12±0,09 | 97±9,2 | |
Смещение ионного равновесия происходит, по-видимому, из-за снижения активности Na, К-АТФ-азы в проведенных нами экспериментах (таблица 2).
Таблица 2
Активность АТФ-азы в клетках монгольских песчанок под влиянием токсина чумного микроба (мкМ Рн /мг белка/час)
| АТФ-аза | Клетки (n=8) и цитозольная фракция | К | Опытные пробы | % |
| АТФ-аза (общая) | n=6 целые клетки | 41,2 | 28,2 | 68 % |
| цитозольная фракция | 32,8 | 23,1 | 70,4 % | |
| Сa++, Mg++ АТФ-аза | Целые клетки | 27,5 | 26,2 | 95,2 % |
| цитозольная фракция | 24,3 | 21,8 | 89,7 % | |
| Na+, K+ АТФ-аза | Целые клетки | 13,7 | 2,0 | 14,6 % |
| цитозольная фракция | 8,5 | 1,3 | 15,3 % |
Под влиянием МТ чумного микроба отмечалось снижение АТФ-азной активности как в целых клетках, так и мембранах. При добавлении в инкубационную среду сердечного гликозида – строфантина С (уабаин) в концентрациях 0,4•10-4 М – 10-6 М Na, К-АТФ-аза почти полностью ингибировалась.
Согласно литературным данным [1] концентрация ионов Са2+ в цитозоле эукариотических клеток поддерживается на гораздо более низком уровне (<10-7 М). Поток ионов Са2+, устремляющийся по столь крутому градиенту в ответ на внесение сигнала, – важный способ передачи таких сигналов через плазматическую мембрану внутрь клетки. Градиент частично поддерживается с помощью существующих в плазматической мембране Са2+-насосов, активно выводящих Са2+ из клетки. Известно, что некоторые из таких насосов представляют собой АТФ-азы. Кальциевая АТФ-аза осуществляет сопряженный с гидролизом АТФ перенос ионов Са2+.
Что касается Са++ АТФ-азы в наших экспериментах на спленоцитах монгольских песчанок под влиянием «мышиного» токсина чумного микроба, то они не отличались от контрольных. ИоныCl- уменьшаются как у монгольских песчанок, так и у белых мышей и морских свинок при введении им МТ. Изменение электролитного состава крови соответствует общей направленности сдвигов показателей кислотно-щелочного гомеостаза крови. При снижении рН увеличивается содержание ионов Na+ и К+ в крови, а из-за повышения СО2 наступает повышение Н2СО3 , растворенного СО2и НСО3, а также снижается содержание хлоридов (Cl-).
Под влиянием токсина отмечалось снижение АТФ-синтетазной активности до 18–15,5 % по сравнению с контролем (таблица 3).
Таблица 3
АТФ-синтетазная активность (в нМ/мг/мин) мембранных фракций спленоцитов монгольских песчанок под влиянием токсина чумного микроба (М±m)
| Проба | Контроль | Токсин | Р |
| С индикатором феноловым красным (n=7) | 615±102 | 520±90 | <0,5 |
| С АТФ – регенерирующей системы | 458±76 | 387±62 | <0,5 % |
Следует учесть, что мембранные препараты были гетерогенны и состояли как из «сопряженных», так и из «несопряженных» структур, из которых одни были способны к синтезу АТФ и генерации электрохимического потенциала при гидролизе АТФ, а другие характеризовались свободной проницаемостью мембран для Н+ и не синтезировали АТФ, а добавление токсина чумного микроба, вероятно, приводило к включению в гидролиз АТФ и АТФ-аз, ассоциированных с «сопряженными» участками.
Что касается количественного содержания АТФ, то токсин Yersinia pestis снижает количество растворимой клеточной АТФ почти наполовину (58 %) по сравнению с контрольными клетками.
Процесс окислительного фосфорилирования в клетках катализируется сложной полиферментной системой, включающей АТФ-синтетазный комплекс и локализованные на мембране компоненты дыхательной цепи, которые участвуют в генерации электрохимического потенциала ионов водорода. Внутренняя мембрана во всех клетках выполняет одинаковую функцию, обеспечивая сопряжение окисления с синтезом АТФ. Синтез АТФ осуществляется за счет энергии мембранного потенциала и сопряжен с трансмембранным переносом Н+.
Таким образом, у экспериментальных животных под влиянием МТ (сублетальных доз – 0,5–1 мкг) по данным электролитного состава крови, активности АТФ-азы общей, Na+, К+, Са++-зависимой можно диагностировать гипоксическое состояние, в частности, метаболический ацидоз.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Альбертс, Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис и др. – Т. 2. – С. 168.
2. Васильева, Е.А. Биохимия / Е.А. Васильева, М.В. Панченко, А.Д. Виноградов. – 1989. – Т. 54, № 9. – С. 1490.
3. Фриске–Суббароу // J. Biol. chem. – 1925, V. 66. – P. 375.
4. Ehresmann B., Imbault., Wiel J.H. // Analyt. Biochem. – 1973, V. 54, № 2. – P. 454.
5. Lowry O.H., Rosenbrough N.Y., Farr A.L., Randal R.J. // J. Biol. chem. – 1951,V. 193. – P. 265.
6. Robin, E.D. Of men and mitochondria: coping with hypoxia disoxia: The 1980 J. Burns amberson secture // American rivien of respiratory disease. – 1980, V. 122, № 4. – P. 517.