Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

BIOCONVERSION OF A FAT INDUSTRY WASTE THE LIPASE OF YEAST YARROWIA LIPOLYTICA

Репин П.С., Корнеева О.С., Карманова О.В.
Optimum conditions of hydrolysis by Yarrowia lipolytica yeast lipase of the fat industry waste was studied at the low maintenance of water and presence at a reactionary mix the calcium oxide. It allows to use hydrolysis products in the technology of rubber wares. Keywords: lipase, enzyme hydrolysis, fat-contained waste, emulsion «water in fat»

Липолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности. Однако их использование ограничивается гидролизом субстрата, представляющего собой водную эмульсию жира. Это связано с тем, что при гидролизе эмульсии типа «жир‒вода» дисперсионная среда берется в избытке для достижения практически полной степени деструкции глицеридов за счет смещения равновесия в сторону образования конечных продуктов. Получаемые при этом гидролизаты представлены в виде водного раствора, и для их дальнейшего использования необходимы стадии отделения воды, сушки, а также очистки сточных вод, что нерентабельно. Литературных данных, описывающих применение липаз для расщепления триглицеридов в условиях обратной эмульсии, крайне мало.

Биодеструкция жира при использовании эмульсии «вода‒жир» позволит избежать вышеуказанных недостатков, а также осуществить переработку крупнотоннажных отходов масложирового производства, содержащих кроме масел и жиров минеральные компоненты [3], препятствующие эмульгированию глицеридов в воде. Полученные при этом гидролизаты ‒ моно-, ди- и триацилгилцериды, жирные кислоты ‒ могут быть в дальнейшем использованы в производстве резино-технических изделий (РТИ)в качестве вторичных активаторов вулканизации, диспергаторов ингредиентов и мягчителей резиновых смесей и др. [4-6].

Основным требованием к применяемым в технологии РТИ добавкам является их влажность, значение которой не должно превышать 0,5‒1 %, в связи с чем была поставлена цель: подбор оптимальных условий биодеструкции отходов масложировой промышленности с низким содержанием воды (до 10 %). Для этого в реакционную среду дополнительно вносили оксид кальция [4].

Материалы и методы исследования

В работе использовали отход стадии дополнительного саломаса и липазу дрожжей Yarrowia lipolytica (ГосНИИГенетика) со степенью очистки Г10х, химические реактивы марок: х.ч., ч.д.а., ч.

Гидролиз проводили в лабораторных реакторах объемом 15 см3. Предварительно усредненную навеску отхода 10 г (содержание жира 50‒55 % мас.) помещали в реактор, где при 40°С и постоянном перемешивании с использованием лабораторной двухлопастной мешалки расплавляли до однородной массы. Далее в реактор добавляли CaO в виде мелкодисперсного порошка. Фермент растворяли в фосфатно-цитратном буферном растворе (pH 7,0) и, предварительно нагрев до 40°С, вносили в реакционную смесь. Перемешивание осуществляли в течение первых 10 минут. Дальнейшее перемешивание при данной температуре затруднялось из-за образования в смеси более высокоплавких продуктов: моно- и диацилглицеридов. Гидролиз продолжали в статических условиях при комнатной температуре (23±3°С) в течение 1-5 суток.

Об эффективности протекания процесса судили по кислотному числу, характеризующему содержание свободных жирных кислот и определяемому по ГОСТ 52 110-2003 с предварительной экстракцией жировой фазы смесью растворителей (диэтиловый эфир и этиловый спирт в соотношении 2 : 1), по массовому количеству кальциевых солей жирных кислот, характеризующему содержание связанных жирных кислот и определяемому по ГОСТ 5480-59 с предварительной экстракцией карбоксилатов горячим толуолом. Общий выход жирных кислот (сумма свободных и связанных в кальцевые соли кислот) в результате гидролиза оценивали по объему соляной кислоты (0,05 моль/дм3, ацетоновый раствор), пошедшему на титрование избытка добавленного спиртового раствора KOH (2 моль/ дм3, спиртовой раствор) в ацетоновой среде в присутствии тимолфталеина.

Оценку липидного состава проб осуществляли методом тонкослойной хроматографии. Анализ проводили на пластинках марки «Sorbfil-ПТСХ-АФ-А» (100×100 мм). Система растворителей: петролейный эфир (40-70) : диэтиловый эфир : уксусная кислота = 80 : 20 : 1 [2]. Проявление хроматограмм осуществляли в эксикаторе, насыщенном парами йода. Проявленные хроматограммы сканировали при разрешении 600 dpi (точек на дюйм). Обработку хроматограмм проводили с использованием программы «ТСХ-Менеджер 4.0.1».

Результаты исследования и их обсуждение

Подбор концентраций и дозировок компонентов для проведения ферментативного гидролиза осуществляли по методу латинского квадрата 4×4 [1]. Рассматривалось влияние следующих факторов: фактор «A» ‒ масса вносимого в реакционную среду оксида кальция, фактор «B» ‒ объем вносимой воды (объем буферного раствора), фактор «C» ‒ дозировка липазы. Об эффективности протекания гидролиза судили по общему выходу жирных кислот (в % от теор.) через двое 2 суток проведения процесса. Результаты эксперимента обрабатывались на ПЭВМ с использованием метода регрессионного анализа (таблица).

Из таблицы следует, что все из исследуемых факторов оказывали влияние на степень ферментативного гидролиза жира в заданных условиях. Увеличение дозировки оксида кальция способствовало росту выхода конечного продукта гидролиза. Однако увеличение концентрации CaO свыше 20 % к массе отхода не позволяло получить однородную массу в заданных условиях, поэтому за оптимальное значение приняли дозировку оксида 20 % к массе отхода. Меньшее влияние на процесс оказывал другой из исследуемых факторов - дозировка воды. Зависимость выхода жирных кислот от фактора «B» носила нелинейный характер, и при увеличении дозировки воды с 9 до 12 % к массе отхода выход кислот возрастал менее чем на 1 %. Учитывая цель настоящего исследования ‒ проведение ферментативного гидролиза при низком содержании воды, за оптимальную концентрацию приняли 9 % воды к массе отхода. Наибольшее влияние на выход жирных кислот оказывал фактор «C». Увеличение количества вносимого фермента в реакционную смесь с 7 до 14 ед. Е/ г жира приводило к возрастанию выхода жирных кислот более чем в 1,5 раза. Дальнейшее повышение концентрации липазы с 14 до 21 ед. Е/г жира увеличивало выход продукта гидролиза лишь на 10 %, что говорит о нецелесообразности повышения дозировки фермента свыше 14 ед. Е/г жира.

Выход жирных кислот в зависимости от исследуемых факторов 

Наименование фактора

Номер уровня

Значение фактора

Значение функции отклика

(общий выход жирных кислот,

в % от теор.)

Фактор «A» - дозировка CaO,
в % к массе отхода

1

5

33,3

2

10

35,8

3

15

41,7

4

20

48,4

Фактор «B» - дозировка H2O,
в % к массе отхода

1

3

37,9

2

6

39,7

3

9

41,6

4

12

42,1

Фактор «C» - дозировка липазы,

ед. Е/г жира

1

7

27,1

2

14

41,0

3

21

45,4

4

28

45,5

Для определения продолжительности гидролиза отхода исследовали динамику процесса в течение 5 суток при комнатной температуре в статическом режиме (рис. 1). Реакционная смесь содержала: 20 % CaO и 10 % H2O к массе отхода. Дозировка липазы дрожжей Yarrowia lipolytica ‒ 14 ед. Е/г жира.

1

Рис. 1. Динамика изменения состава реакционной массы:
1 ‒ общий выход жирных кислот; 2 ‒ содержание связанных в кальциевые соли жирных кислот; 3 ‒ содержание свободных жирных кислот

Общий выход жирных кислот в гидролизате (рис. 1) достигал максимального значения через двое суток проведения гидролиза. Далее в реакционной смеси происходило образование только карбоксилатов кальция при одновременном снижении концентрации свободных жирных
кислот.

Для оценки изменения липидного состава реакционной смеси отбор проб осуществляли через 1, 3 и 5 суток после начала гидролиза. Как показывают денситограммы проб (рис. 2), промежуточными продуктами процесса являлись 1,2-диацилглицериды и О-диалкилмоноглицериды. Последние, вероятно, образовались в результате взаимодействия высших жирных спиртов, присутствующих в отходе, и моноацилглицеридов, образующихся в результате гидролиза. Максимальное количество данного продукта отмечено на третьи сутки проведения гидролиза, после чего количество его в среде заметно снижалось. Площадь пика, соответствующая жирным кислотам на третьи и пятые сутки гидролиза, оставалось неизменной, что согласуется с представленными ранее данными
(рис. 1). Высота пика триглицеридов снижалась в течение всего периода проведения процесса.

Полученный в результате ферментативного гидролиза отхода гидролизат сушили при 60°С в течение 60 минут. Влажность полученного порошка не превышала 1 %. Продукт был испытан в резиновых смесях на основе этиленпропиленового каучука марки «DUTRAL TEP» в качестве технологической добавки. Содержание его в опытных образцах резин составляло 2‒5 мас. ч. на 100 мас. ч. каучука дополнительно к серийному рецепту.

Результаты испытаний показали, что опытная технологическая добавка в исследуемом диапазоне концентраций оказывала пластицирующее влияние на резиновые смеси. Вязкость опытных образцов снижалась до 138‒134  усл. ед. по Муни по сравнению с серийным (143 усл. ед.). Одновременно наблюдалось снижение времени достижения оптимума вулканизации с 12,24 минут до 11,62, что свидетельствует об активирующем влиянии исследуемого продукта на вулканизационные характеристики резиновых смесей. Также отмечено некоторое улучшение упруго-прочностных свойств резин с исследуемой добавкой: условная прочность при растяжении составляла 13,6‒15,8 МПа при значении данного показателя для серийной резины 13,5 МПа; увеличение относительного удлинения при разрыве возросло приблизительно на 15 %; сопротивление раздиру увеличилось с 41 кН/м у серийного образца до 47 кН/м у опытного. По-видимому, это связано с проявлением диспергирующего эффекта предложенной технологической добавки и улучшением распределения наполнителей и компонентов вулканизующей группы в ее присутствии.

Заключение

Проведенные исследования позволили установить, что максимальный выход жирных кислот и их солей в результате гидролиза отхода стадии дополнительного отбеливания саломаса липазой дрожжей Yarrowia lipolytica наблюдается при внесении фермента в количестве 14 ед. Е/г жира и содержании в реакционной смеси 20 % оксида кальция и 9-12 % воды к массе отхода в течение 4‒5 суток при комнатной температуре в стационарном режиме.

Полученный гидролизат, содержащий свободные жирные кислоты и их соли, моно-, ди- и триглицериды, после сушки можно рассматривать как технологическую добавку, выполняющую функции диспергатора, мягчителя и активатора вулканизации, для резиновых смесей на основе этиленпропиленового каучука.

2

Рисунок 2. Характеристика изменения липидного состава реакционной смеси

через 1, 3 и 5 суток гидролиза

Список литературы

  1. Ахназарова С.Л., Кафаров В.В. Методы оптимизации эксперимента в химической технологии : учеб. пособие для хим.-технол. спец. вузов. ‒ 2-е изд., перераб. и доп. ‒ М. : Высш. шк., 1985. ‒ 327 с.
  2. Лабораторный практикум по химии жиров / Н.С. Арутюнян, Е.П. Корнена, Е.В. Мартовщук и др.; под ред.проф. Н.С. Арутюняна и проф. Е.П. Корненой. ‒ 2-е изд., перераб. и доп. ‒ СПб. : ГИОРД, 2004. ‒ С. 145-148.
  3. О´Брайен, Р. Жиры и масла. Производство, состав, свойства, применение; пер. с англ. 2-го изд. В. В. Широкова, Д. А. Бабейкиной, Н. С. Селивановой, Н.В. Магды. ‒ СПб. : Профессия, 2007.‒ 752 с.
  4. Патент РФ № 2015161, 30.06.94.
  5. Рахматулина А.П. Влияние стеариновой и олеиновой кислот на молекулярно-топологическое строение резин на основе бутадиен-метилстирольного каучука / А.П. Рахматулина, Ю.А. Ольхов, Р.А. Ахмедьянова, А.Г. Лиакумович // Каучук и резина. ‒ 2005. ‒ №3. ‒ С. 17-22.
  6. Шутилин Ю.Ф. Справочное пособие по свойствам и применению эластомеров : монография. ‒ Воронеж: ВГТА, 2003. ‒ 871 с.

Рецензенты:

Лукин Алексей Леонидович, д.с.-х.н., профессор, зав. кафедрой биохимии и микробиологии, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки» Министерства сельского хозяйства РФ;

Кузнецов Вячеслав Алексеевич, д.х.н., доцент, кафедры химии высокомолекулярных соединений и коллоидов государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» Министерства образования и науки РФ.