Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Негативное влияние химических соединений искусственного происхождения на репродуктивное здоровье человека и животных в последние десятилетия привлекает внимание многих специалистов [1]. Исследования, выполненные в разных странах, подтверждают, что на протяжении последних десятилетий наблюдается постоянное снижение качества спермы человеческой популяции в целом [2,3,4]. Большинство авторов при попытке объяснения причин данного феномена отмечают связь выявленных тенденций с прогрессивным ростом на протяжении прошлого века уровня загрязнения окружающей среды [5,6].

Изучение действия стойких органических загрязнителей, в том числе отдельного класса, одних из самых распространенных экотоксикантов - полихлорированных бифенилов (ПХБ) представляет особую актуальность [7]. ПХБ обладают высокой липофильностью и физико-химической стабильностью, что наряду с низкой скоростью биологической деградации приводит к их накоплению в объектах неживой природы и, особенно, аккумуляции в липидных структурах живых организмов, возрастающей по пищевой цепи, конечным звеном которой является человек [8].

В литературе накапливаются сведения о том, что интоксикация ПХБ мужского организма сопровождается изменениями гормонального профиля половых стероидов, уменьшением объема и ухудшением функциональных параметров спермы [9,10]. Однако в проблеме токсического поражения мужской половой системы бифенилами остается еще много нерешенных вопросов. Между тем объективный анализ причин, вызывающих угнетение мужской фертильности, и разработка эффективных патогенетически обоснованных методов коррекции нарушений требуют целенаправленного исследования молекулярно-биологических механизмов патогенеза токсического действия бифенилов на репродуктивную систему в целом.

Цель исследования

Оценить оксидантный статус эпидидимиса крыс, подвергшихся экспериментальной интоксикации полихлорированными бифенилами.

Материал и методы исследования

Экспериментальные исследования выполнены на 60 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста массой 180-220 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении опытов соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Экспериментальную интоксикацию вызывали внутрижелудочным введением раствора «Совол», включающего 26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гексахлорбифенилов и следовые количества гептахлорбифенилов.

Все животные были разделены на 6 групп. Крысам групп 1 и 4 (контрольные группы) ежедневно вводили оливковое масло в объеме 1 мл в течение 14 и 28 дней соответственно. Самцы групп 2 и 5 подверглись отравлению полихлорбифенилами в суточной дозе 10,7 мг/кг массы тела в течение 14 и 28 дней соответственно. Животные групп 3 и 6 получали токсикант в течение 14 и 28 суток соответственно по 21,4 мг/кг массы тела в день.

По истечении срока модельной интоксикации подопытных животных декапитировали, извлекали эпидидимис, помещали на лед, иссекали ножницами и гомогенизировали в фосфатном буфере. В полученных гомогенатах определяли содержание аскорбиновой кислоты [11], α-токоферола [12], глутатиона восстановленного (ГВ) [13], свободных сульфгидрильных групп (ССГ) [14], активности глутатионпероксидазы (ГПО) [15], глутатионредуктазы (ГР) [16], глутатион-S-трансферазы (ГТ) [17], гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) [18]. Концентрацию соединений тиобарбитуровой кислоты (ТБК-РП) определяли с помощью диагностических наборов производства ООО «Агат-Мед» (Россия), общую антиокислительную активность (ОАА) исследовали по Клебанову [19].

Математическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 6,0 фирмы Stat Soft для обработки статистической информации. В группах выборки оценивали следующие параметры: значения медианы, нижний и верхний квартили. Оценку достоверности различий проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты количественного определения продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, представлены в табл. 1. Обнаруженный резкий прирост молекулярных маркеров липопероксидации носил выраженный дозо- и хронозависимый характер. Так, пероральное введение лабораторным животным смеси ПХБ в дозе 10,7 мг/кг/сут уже к середине срока подострого отравления сопровождалось значительным увеличением ТБК-РП в гомогенате придатка на 82,3%, р<0,0008, а к окончанию всего срока подострой интоксикации - более чем двукратным по сравнению с уровнем контроля.

Таблица 1

Влияние подострой интоксикации ПХБ на общую антиоксидантную активность и содержание ТБК-РП в эпидидимисе экспериментальных животных 

Ежесуточное поступление «Совола» в большем количестве - 21,4 мг/кг - приводило к достоверному трех-четырехкратному приросту продуктов ПОЛ в анализируемых образцах. Окислительный взрыв такой мощности, очевидно, невозможен без заметных сдвигов в структуре антиоксидантной системы придатка яичка. Это убедительно доказали дальнейшие исследования (табл. 1). Максимальное падение ОАА было зарегистрировано к окончанию срока подострой интоксикации у крыс группы D, составившее 29,3%, р<0,0143 от уровня контроля.

Последующий анализ выявил заметные нарушения в структуре антиоксидантов прямого действия и энзиматического звена (рис. 1). Зафиксировано статистически значимое снижение концентрации восстановленного глутатиона от уровня интактных животных на 24,8%, р<0,0283 (группа 6).

Ранние сдвиги обнаружены при определении содержания антиоксидантов, функционирующих в разных (липидной и водной) фазах клеточной среды. Уже на 14-й день интоксикации ПХБ в дозе 21,4 мг/кг/сут уровни как аскорбата, так и токоферола оказались сниженными до 76,7%, p<0,0283 и 69,5%, p<0,0081 по отношению к контрольным значениям. С увеличением дозы ксенобиотика падение содержания витаминов С и Е усилилось и составило 40,9%, p<0,0007 и 43,4%, p<0,0008 соответственно.

Наблюдавшееся в ранние сроки воздействия малых доз ПХБ усиление глутатионтрансферазной реакции на 29,6%, р<0,0283 на 28-й день наблюдения сменялось угнетением фермента до 81,3%, р2-5<0,0008 от уровня контроля (рис. 2). На момент окончания подострого отравления «Соволом» 0,1 ЛД50 (группа 6) активности ГПО и ГТ оказались значительно сниженными на 34,4%, р<0,0081 и 25,4%, р<0,0412 соответственно по сравнению с показателями интактных животных.

Рис. 1. Динамика содержания аскорбата, токоферола, глутатиона восстановленного и свободных сульфгидрильных групп в эпидидимисе крыс при подострой интоксикации «Соволом» (% от контроля, n=10)

В сложившихся условиях повышенного потребления восстановленных форм глутатиона зарегистрированные сдвиги в системе обмена ГВ следует, вероятно расценивать как адаптивные. Так, на 14-й день введения экспериментальным животным 10,7 мг/ кг/ сут смеси ПХБ наблюдалась активация ГР и ГГТ на 30,7%-50,6% соответственно. Индукция ГГТ в эпидидимисе сохранялась в эти же сроки наблюдения, а также при воздействии большей дозы токсиканта (21,4 мг/кг/сут), составив 131,2%, р<0,0493 по отношению к контролю (рис. 2).

Рис. 2. Активность глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы, гаммаглутамилтрансферазы в эпидидимисе крыс при подострой интоксикации «Соволом» (% от контроля, n=10)

В остальных экспериментальных условиях статистически значимых отличий ферментативной активности от контрольных значений не выявлено.

Роль и значение эпидидимиса в реализации мужской репродуктивной функции заключается в транспортировке, хранении, концентрировании и обеспечении условий для структурно-функционального созревания гамет, в процессе которого спермии приобретают способность к движению и оплодотворению яйцеклетки [20]. Одной из биохимических основ этих процессов является активная генерация свободных радикалов в физиологических концентрациях [21]. Самые незначительные и разнонаправленные сдвиги в функционировании про- и антиоксидантных систем эпидидимиса способны нарушить тонкий редокс-контроль оксидантного баланса, что неизбежно приводит к нарушению формирования полноценных сперматозоидов [20,21].

Исходя из этого, совокупность вышеописанных изменений оксидантного статуса эпидидимиса крыс, подвергшихся подострому отравлению полихлорированными бифенилами, может оказывать существенное влияние на оплодотворяющую способность самцов. Анализ полученных данных показывает, что при всех экспериментальных моделях интоксикации наблюдается интенсификация процессов липопероксидации на фоне последовательного уменьшения общей антиокислительной активности в придатке яичка. Результаты динамического изучения отдельных компонентов антиоксидантной системы в различных условиях токсической нагрузки свидетельствуют о нарушениях как в структуре неферментативного, так и энзиматического звеньев АОС. В качестве узлового момента развивающегося под действием полихлорбифенилов окислительного стресса можно рассматривать поражение глутатионзависимого метаболизма. При этом если при меньшей токсической нагрузке, метаболические сдвиги в глутатионовой системе направлены на поддержание возросших потребностей тканей в восстановленном кофакторе и носят отчетливый адаптивный характер, то увеличение продолжительности и интенсивности воздействия ксенобиотика сопровождается заметным угнетением систем ресинтеза и регенерации глутатиона, что влечет за собой истощение компенсаторных ресурсов клетки.

Заключение

Согласно экспериментальным данным, развивающийся в эпидидимисе окислительный стресс может являться одним из ведущих механизмов репротоксического действия бифенилов и возможной причиной ухудшения мужской фертильности при интоксикации промышленными ядами.

Список литературы

1. Rhind S.M. Anthropogenic pollutants: a threat to ecosystem sustainability? // Phil. Trans. R. Soc. - 2009. - Vol. 364. - P. 3391- 3401.
2. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years / E. Carlsen, A. Giwercman, N. Keiding, N.E. Skakkebaek // BMJ. - 1992. - Vol. 305. - P. 609-613.
3. Sharpe R.M. How strong is the evidence of a link between environmental chemicals and adverse effects on human reproductive health? / R.M. Sharpe, D.S. Irvine // BMJ. - 2004. - Vol. 328. - P. 447-451.
4. Delbès, G.Toxicants and human sperm chromatin integrity / G. Delbès, B.F. Hales, B. Robaire // Mol. Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16(1). - P. 14-22.
5. Persistent Organic Pollutants in Source-Separated Compost and Its Feedstock Materials-A Review of Field Studies // R.C. Brändlia, T.D. Buchelib, T. Kuppera [et al.] // J. Environ Qual. - 2005. - Vol. 34. -
   P. 735-760.
6. Phthalates Impair Germ Cell Number in the Mouse Fetal Testis by an Androgen- and Estrogen-Independent Mechanism / A. Lehraiki, Ch. Racine, A. Krust [et al.] // Toxicol. Sci. - 2009. - Vol. 111. - P. 372-382.
7. Endocrine disruptive chemicals: mechanisms of action and involvement in metabolic disorders / E. Swedenburg, J. Rüegg, S. Mäkelä [et al.] // Journal of Molecular Endocrinology. - 2009. - Vol. 43. - P. 1-10.
8. Toxicity of Polychlorobiphenyls and its Bioremediation / De Supriyo, S.K. Pramanik, A. L. Williams // J. Hum Genet. - 2004. - Vol. 4(4). - P. 281-290.
9. Камилов Ф.Х. Механизмы повреждения действия полихлорированных бифенилов на мужескую репродуктивную систему / Ф.Х. Камилов // Зравоохранение Башкортостана. - Спец. вып. - 2005.  № 7. - С. 93-94.
10. Impact of polychlorinated biphenyl Aroclor 1254 on testicular antioxidant system in adult rats / P. Murugesan, J. Senthilkumar, K. Balasubramanian [et al.] // Human Experim. Toxicol. - 2005. - Vol. 24. - P. 61-66.
11. Omaye S.T. Selected methods for the determination of ascorbic acid in animal cells, tissues and fluids / S.T. Omaye, J.W. Turnball, H.E. Sauberlich // Methods in Enzymology. - 1971. - Vol. 62. - P. 1-11.
12. Desai I.D. Vitamin E analysis methods for animal tissues // Methods in Enzymology. - 1984. - Vol. 105. - P. 138- 147.
13. Карпищенко А.И. Глутатион-зависимая антиоксидантная система в некоторых тканях крыс в условиях острого отравления дихлорэтаном / А.И. Карпищенко, С.И. Глушков, В.В. Смирнов // Токсикологический вестник. - 1997. - № 3. - С. 17-23.
14. Bellomo G. Modulation of cellular glutathione and protein thiol status during quinone metabolism / G. Bellomo, H. Thor, S. Orrenius // Methods in Enzymol. - 1990. - Vol. 186. - P. 627-635.
15. Гаврилова А.Н. Определение активности глутатионпероксидазы эритроцитов при насыщающих концентрациях субстратов / А.Н. Гаврилова, Н.Ф. Хмара // Лабораторное дело. - 1986. - № 12. - С. 21-24.
16. Carlberg I. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation / I. Carlberg, B. Mannervik // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249.
17. Habig W.H. Glutathione-S-transferase. The first enzymatic step in mercapturic formation / W.H. Habig, M.J. Palst, W.B. Jakoby // J. Biol. Chem. - 1973. - Vol. 249. - Р. 7130-39.
18. Orlowski M. Isolation of gamma-glutamyl transpeptidase from hog kidney / M. Orlowski, A. Meister // J. Biol. Chem. - 1965. - Vol. 240. - P. 338-47.
19. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов / Г.И. Клебанов, И.В. Бабенков, Ю.О. Теселкин [и др.] // Лабораторное дело. - 1988. - № 2. - С. 59-62.
20. Turner T.T. De Graaf´s Thread: The Human Epididymis // J. Androl. - 2008. - Vol. 29. - P. 237-250.
21. Ford W.C.L. Regulation of sperm function by reactive oxygen species // Hum. Reprod. Update. - 2004. - Vol. 10. - P. 387-399.