Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В основе многих видов акушерской патологии лежит развитие генерализованной микроангиопатии и тромбофилии, связанных с аутоиммунными нарушениями, гипергомоцистеинемией, наследственными дефектами системы гемостаза.Существенно возрастает риск развития тромбозов уженщин при наследственной предрасположенности к данной патологии в результате провоцирующих воздействий, таких как прием оральных контрацептивов, беременность, хирургические вмешательства. В то же время известно, чтообщие скрининговые тесты, используемые для выявления маркеров тромбинемии, не позволяют идентифицироватьту или иную причину склонности к внутрисосудистому свертыванию и, следовательно, этот прием недостаточен для выбора патогенетической терапии [3,5,6,8]. В этой связи особого внимания ученых заслуживают наследственныеформы недостаточности ингибиторов свертывания или аномалии коагуляционных протеинов, обусловливающих состояние предтромбоза и предрасположенности к тромбозу, поскольку встречаются у лиц молодого возраста и зачастую протекают без клинических проявлений [1,4,9].

В задачиданной работы входилоизучение частоты встречаемости полиморфных вариантов ряда генов, кодирующих протеины системы гемостаза ифолатного цикла упациенток Западно-Сибирского региона - практически здоровых и с верифицированным диагнозом тромбозов различной локализации.С этой целью проведено комплексное исследование венозной крови, включившее тестирование генов-кандидатов предрасположенности к развитиютромботических состояний.

Материал и методы

Для изучения распространенности полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного цикла были обследованы 290женщин-жительниц г. Новосибирска и Новосибирской области в возрасте от 16 до 43 лет. Генетическое тестирование образцов венозной крови проводилось по направлениям от гинекологов, терапевтов и уженщин, самостоятельно обратившихся в лабораторию генодиагностики ЦНМТ в Академгородке ИХБФМ СО РАН с тем, чтобы пройти тест на приемлемость контрацепции, гормонально-заместительной терапии (ГЗТ)или для выявления факторов, способных осложнять течение предстоящей беременности.Большинство женщин были направлены на тестирование 4-х генов - FVG1691A, FIIG20210A, MTHFRC677T, MTRRA66G. Проанализированы 2 группы пациенток - в 1-ю группувошли 265женщин без клинических проявлений тромбофилии, 2-ю группусоставили25 пациентокс различнымитромботическими осложнениями. У 4-х пациенток развилась массивная ТЭЛА в возрасте 21 года, 22, 36 и 43-хлет на фонеприема оральныхконтрацептивов (ОК) и ГЗТ, утрех пациентокдиагностирован ишемический инсульт в возрасте 21 год, 30 лет и42 года, остальные наблюдались стромботическими эпизодами в анамнезе - тромбозом глубоких вен (ТГВ), тромбофлебитом поверхностных вен.Средний возраст пациенток в обеих группах был сопоставим и составил 32,5+8,5 в 1-ой группеи 30,3+10 во 2-ой группе.В исследование вошли 19 генов-кандидатов(25 аллельных вариантов), продукты которых участвуютв коагуляционном каскаде, системе фибринолиза,поддержании сосудистого тонуса,метаболизме метионина и фолиевой кислоты. Генотипирование проводилось методом ПЦР с использованием конкурирующих TagMan-зондов, комплементарных полиморфному участку ДНК.

Статистическая обработка результатов

Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций методом χ² проводили с помощью программы DeFinetti [13].Для всех статистических расчетов при p-value <0,05 результат считали статистически значимым.

Результатыи их обсуждение

Результаты определения нами частот встречаемости полиморфизмов генов предрасположенности к тромбофилии представлены в таблице.

Частота встречаемости аллелей, генотипов полиморфных локусов исследуемых
генов в 1-ой и 2-ой группахженщин репродуктивного возраста и их ассоциация
с тромбозами различной локализации (OR)

Примечание: * критерий χ² использован для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.Распределение частот генотипов соответствует закону Харди-Вайнберга во всех группах для всех исследуемых генов   

По данным нашего исследования,распространенностьлейденской мутации в гене FV у женщин репродуктивного возраста, проживающих на территории г. Новосибирска и Новосибирской области, в целом по группе составила 3,3 % и практически не отличается от частоты встречаемости данной мутации в европейской популяции.У женщин без клинических проявлений тромбофилии процент встречаемости полиморфизма FVбыл равен 1,97. В группе больных с верифицированным диагнозом тромбоз глубоких вен (ТГВ), ишемический инсульт, тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) частота гетерозиготного варианта гена FV составила 4,7 %, и ни в одном случае не была зарегистрирована гомозиготная форма гена. Этот факт указывает на некоторые отличияот частотмутаций данного гена у пациенток европейской популяции с тромботическими эпизодами в анамнезе. Так, по данным[1] частота гомозиготной формы мутации FVLeidenпри тромбозах выявлена в 17,6 %обследованных и гетерозиготной - в 35,3 %. Заслуживающим внимания, на наш взгляд,является факт отсутствиямутации в гене протромбина G20210Aу обследованных намипациенток с верифицированным диагнозом тромбозов. Известно, что этамутация достаточно редко встречается в популяции (1 - 4 %), но среди больных с венозными тромбозами достигает 17-20 % [1, 2, 9]. Мы не выявили также различий в распространенности мутаций в гене протромбина (FII), связанной с заменой GAсреди женщин практически здоровых и пациенток с тромботическими осложнениями. В целом для общего числаобследованных частота гетерозиготного вариантаGA 20210 гена протромбина составила 1,75. Гомозиготная форма не была выявлена ни у одной из обследованных женщин. У больных с эпизодами тромбозов (2-ая группа) в 100 % случаев регистрировался «дикий» тип гена (вариант G/G).

Работами многочисленных авторов показано, что ведущими причинами в генезе венозных тромбоэмболий являются мутационные повреждения гена фактора V свертывания крови (лейденская мутация) и гена протромбина (аллель 20210А). Риск развития тромботических осложнений особенно высок при сочетании мутаций в гене протромбина GA 20210 с FV (фактор Лейдена) [3,10].

Частоту «мутированных»генов FV и FII в общей структуре полиморфизмов у женщин с тромбозами, выявленную в нашем исследовании, можно было бы рассматривать как показатель достаточноблагоприятной ситуации в плане распространенности наследственнойтромбофилии среди женщин, проживающих в Западно-Сибирском регионе. Однако,на наличие генетически обусловленной тромбофилии указывают находки при скрининге более широкого спектра генов системы гемостаза и фолатного цикла(см. табл.).

Изучение генов системы фолатного цикла было обусловлено их высокой патогенетической значимостью в развитии тромбофилии. Признанным фактором риска развитиясердечно-сосудистых заболеваний и фактором риска развития венозных и артериальных тромбозов на протяжении ряда десятилетий считается гипергомоцистеинемия.В литературе приводятся данные об ассоциации тромбозов с мутацией гена MTHFRС677, приводящей к снижению активности MTHFR и накоплению ГЦ[2,12].

Как видно из Таблицы,среди женщин Западно-Сибирского региона выявлен довольно высокий процент мутаций вэтих генах. Мутации в генеМТГФР С677Т выявлены в 51,4 %, при этом распределение вариантов гена не показало достоверныхразличий для 1-ой и 2-ой групп.В то же время необходимо отметить, чтоу женщин 2-ой группыс тромботическими заболеваниями в55,6 % случаевотсутствовалдефект в гене МТГФР С677Т. Другая ситуациявыявлена при анализе встречаемостимутаций в генах метилентетрагидрофолатдегидрогеназы - MTHFD (1958А->G), метионин синтазыи метионин синтазы-редуктазыMTRR (66A>G). В группе женщин с тромбозами различной локализации редкие аллели этих генов обнаруживались достоверно чаще. Аллель 1258А гена MTHFD является фактором риска развития тромбоза, при его носительстве риск возрастает в 4 раза (OR =4,0 C.I. [1,9-8,6] p=0,00018). При носительстве аллеля 66G гена MTRR также повышается риск тромбоза (OR =4,8 С.I. [2.4-9.9] chi2=21,57 p=3,4e-06) (табл.).

Существуетмнение [12],чтонарушение любого из звеньев как метионинового, так и фолатного цикла может привести к повышению общего содержания гомоцистеина в плазме крови.Мы полагаемвысоко вероятным, что дефект гена MTHFD, который кодирует фермент, осуществляющий превращение одноуглеродных производных тетрагидрофолата и участвует в синтезе метионина, тимидилатаи пурина в сочетании с мутациями в генах MTR и MTRR, которые кодируют аминокислотную последовательностьферментов, участвующихвпроцессах реметилирования гомоцистеина в метионин,может приводить к гипергомоцистеинемии и служить фактором риска тромботических заболеваний у молодых пациенток даже при нормальном (диком) типе гена MTHFR(С677Т).

Наряду с высокой частотой встречаемости гомозиготных вариантов генов MTHFD, MTRR во 2-ойгруппе женщин, как правило, имело место сочетание гомо - и гетерозиготных мутаций нескольких геновфолатного цикла.Комбинация из трех генных полиморфизмов встретилась у 84,2 % больных, присутствие гомозиготного варианта одного или двух полиморфизмоввыявлено в этой группепациенток в 95,3 % случаев. По-видимому, именносочетания генетических полиморфизмовявляются серьезнымфактором риска нарушений в работе ферментов фолатного цикла, приводящих к избыточному накоплению гомоцистеина в плазме крови.

Особого внимания заслуживаетобнаруженная нами комбинация мутированных генов фолатного цикла с наличием полиморфной замены 675 5G -> 4Gгена ингибитора активатора плазминогена (PAI1). Носительствоаллеля 4G, который сопровождается повышенной экспрессией гена и приводит к повышению в крови PAI-1, зарегистрирован нами в 86 % случаев обследованных пациентов. У носителей аллеля 4G675 гена PAI-1 риск тромбозов повышен в 2,6 раз (OR =2,6 С.I.
[1,3-5,4] chi2=7,29 p=0,007). Гомозиготная форма 4G/4Gгена PAI1 во 2-ой группе
в 3 раза превышала таковую по сравнению с женщинами без проявлений признаков тромбофилии.Если в первой группе обследованных женщин гомозиготнаяформа выявлена в 17,5 % случаев, то в группе с тромбозамиэтот процент составил 54,5. В 45 % случаев имело место сочетание полиморфизма PAI-1 сприсутствием полиморфного варианта тканевого активатора плазминогена (PLAT- 7351 С->Т,чтотакже является предиктом снижения высвобождения тканевого активатора плазминогена, приводящим к неэффективному фибринолизу.

Особенностьюженщин репродуктивного возраста с развившимся тромбозом в молодом возрасте явилось наличие мультигенного характера тромбофилии в 100  % случаев. Очевидным было и преобладание сочетаний гомозиготных форм исследуемых генов (MTHFD (1958А->G), MTRR (66A>G), PAI1 (675 5G ->4G ), GРIIIa (1565 Т- С), NSO3 (Glu298Asp) в этой группе, что рассматривается нами в качестве предиктовскрытых форм тромбофилии.Так, замена Т на С в 1565 положении гена GРIIIa приводит к аминокислотной замене лейцина (Leu) на пролин (Pro) в 33-м положении. Тромбоциты, несущие GРIIIa Pro33, имеют более низкий порог активации, то есть они более склонны к агрегации. У носителей 1565C гена GPIIIa риск тромбозов повышен в 2,7 раз (OR =2,7 chi2=4,2 p=0,04).

Комбинации из2-х, 3-х и более«мутированных» генов (чаще гетерозиготных форм) имели место иуженщин без клинических признаков тромбофилии (1-ая группа). Такие находки, даже без изменений в генах FVи FII, по нашему мнению, должны настораживать врача, поскольку при определенных условиях (беременность, операционное вмешательство, использование КОК и ГЗТ) может иметь место реализациипредрасположенности к тромбозам впатологический процесс.Эти пациенты должны быть включены в группы риска развития тромботических осложнений, хотя на момент обследования данных за наличие тромбинемии у нихне выявляется.

Заключение

Несмотря на то, что в мировой практике молекулярно-генетический анализ не используется в качестве скринингового, действительность показывает, чтовопрос о приемлемости контрацепции и заместительной гормональной терапии не может решаться без генетического тестирования пациенток с целью выявления наследственной предрасположенностью к тромбозам. Нами показано, что эти вопросы не могут быть решены и при тестировании ограниченного числа наиболее изученных генов, считающихся безусловными и строгими маркерами наследственной тромбофилии (F.V, FП, MTHFR- С677Т).

Врачи-гинекологи, флебологидолжны иметь данные о дефектах в генах, контролирующих различные звенья сложной системы гемостаза и фолатного цикла, поскольку это может быть основой для выявления скрытых форм тромбофилии у женщин репродуктивного возраста, а также предупреждения тромбозов и купирования повторных эпизодов заболевания. Применение молекулярно-биологических методов дает возможность определять значимые факторы, оказывающие влияние на развитие патологического процесса, выявлять патологию на стадии предболезни, осуществлять поиск патогенетически обоснованных методов профилактики и лечения и, тем самым, снижать риск тромботических осложнений. Эффективность диагностики и лечения во многом зависит от понимания врачом возможностей использования данных генетического анализа для выяснения механизмов развития наследственной тромбофилии.

Список литературы

1. Баранов В.С. Генетические основы предрасположенности к некоторым частым мультифакториальным заболеваниям// Медицинская генетика.2004.Т. 3.С. 102-112.
2. Гипергомоцистеинемия как самостоятельный фактор риска поражений и тромбирования кровеносных смосудов / З.С. Баркаган [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. 2002.№ 1.С. 65-71.
3. Вавилова Т.В. Гемостазиология в клинической практике. Пособие для врачей.СПб, 2005.91 с.
4. Роль генетической тромбофилии в структуре тромботических осложнений у гинекологических больных высокой группы риска в периоперационном периоде / А.Д. Макацария [и др.]// Мед.науки. 2008.№ 1. С. 7.
5. Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. СПб.: Изд-во «ФормаТ», 2006. 209 с.
6. Выявление генетических факторов риска развития сердечно-сосудистой патологии в Северо-Западном регионе России / С.Н. Пчелина [и др.] // Медицинская генетика. 2005. Т. 4. № 6. С. 256.
7. Генетические факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний / С.Н.Пчелина[и др.]// Пособие для врачей. СПб, 2006.С. 25.
8. Стойко Ю.М., Замятина А.В. Патогенетические аспекты консервативной терапии хронической венозной недостаточности у беременных//ConsiliumMedicum 2007/9:6:44-47.
9. Роль полиморфных вариантов некоторых генов, участвующих в развитии эндотелиальной дисфункции, в формировании гестоза/ Е.А. Трифонова [и др.]//Молекул.мед.2009. № 1.С. 3-9.
10. Генетические факторы риска развития тромбозов в молодом возрасте / А.М. Шейдина [и др.]//Вопросы современной педиатрии. 2005. Vol. 4,№ 1.P. 42-46.
11. Genetic variation in coagulation and fibrinolytic proteins and their relation with acute myocardial infarction / S.M.Boekholdt[etal.]// Circulation.2001,Vol. 104.P. 3063-3068.
12. Homocysteine inhibits inactivation of factor Va by activated protein C /A.Undas [etal.]// J.Biol.Chem.2001,Vol. 276.P.4389-4397.
13. http://ihg.gsf.de/ihg/index_engl.html.( Институт генетики человека.Мюнхен, Германия).