Создание и исследование ФФК является важным и актуальным направлением на пересечении ряда областей биохимии, физико-химической биологии и биотехнологии [1, 3, 4, 6, 8].

Для многих флуорофоров (молекулярных роторов) характерна сильная зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости. Для её описания обычно используют уравнение Фёрстера-Гофмана [4, 6]:

lgI = x×lg η + C, (1)

где I - интенсивность флуоресценции; х - константа, меньше либо равная единице; η - вязкость; С - постоянная. Из уравнения, зная интенсивность флуоресценции, находят вязкость после калибровки параметров флуорофора по разным вязкостям в системе, где его планируют использовать.

Спектральные свойства красителей родаминового ряда также зависят от вязкости (хотя молекулярными роторами они не являются) и рН [8]. Фотоактивируемые флуо­ресцентные красители родаминового ряда в этом плане интересны потому, что, облучая окрашенные клетки узким лазерным пучком длиной волны около 400 нм, можно активировать строго ограниченное число молекул ФФК, переведя их во флуоресцентную форму лишь в ограниченном объёме клетки [3]. Данные по влиянию вязкости и рН на флуоресценцию этих красителей можно будет использовать для исследования параметров внутриклеточной среды в различных клеточных структурах [1, 6], что имеет немалое значение для изучения биохимических процессов [2].

Для родаминовых красителей характерно явление концентрационного тушения [7]. Для практического применения красителей важно знать, при каких концентрациях оно начинает оказывать заметное влияние на спектральные свойства.

Целью данной работы являлось изучение влияние параметров микроокружения и концентрационного тушения на спект­ральные свойства ФФК-813 (его открытой формы, называемой Род-813).

Исследуемый краситель (ФФК-813) синтезирован Беловым В.Н. в Макс-Планк Институте биофизической химии (ФРГ), как описано ранее [5].

Для исследования ФФК-813 был растворён в ДМФА до концентрации 10 мг/мл. Далее разбавляли водой до концентрации 200 мкг/мл и подвергали фотоактивации в стандартной кювете для снятия спектра из набора Spectra Suite действием ртутной лампы (100 Вт), помещаемой на расстоянии 3 см от кюветы на 5 минут. Данной операцией переводили краситель из нефлуоресцентной во флуоресцентную форму, как показано на рис. 1, а, и получали маточный раствор:

Для получения спектров Род-813 при рН = 3, 7 и 11 использовали маточный раствор Род-813, дистиллированную воду и 0,01 Н растворы KOH и HCl.

Для исследования зависимости спектральных свойств от вязкости были приготовлены по 975 мкл растворов глицерина в воде в различных концентрациях, к которым добавляли 25 мкл маточного раствора.

Для исследования концентрационного тушения были измерены спектральные свойства Род-813 в растворах убывающих концентраций, приготовленных из маточного путём последовательно повторяемого разбавления его дистиллированной водой.

Для каждого случая были измерены как спектр поглощения, так и флуоресценции на спектрометре «Ocean Optics USB 4000-FL». Измерения проводились в стандартных пластиковых кюветах. Спектр поглощения измеряли с помощью источника света Ocean «Optics PX-2», излучающего в диапазоне 220-750 нм, свет от которого наводился на кювету при помощи оптоволоконного кабеля P400-1-SR; для возбуждения флуоресценции применяли светодиод с длиной волны света 514 нм, который устанавливали в кюветодержатель прибора в неподвижном положении.

Все спектры получены в сравнении с контролями, в качестве которых служили дистиллированная вода или растворы глицерина соответствующей концентрации. В экспериментах по концентрационному тушению для каждой концентрации снимали по 5 спектров поглощения и флуоресценции, в этом случае данные были обработаны путём подсчёта доверительных интервалов по методике Стьюдента.

Для окрашивания монослоя линии клеток А 431 (эпидермоидная карцинома человека) краситель сначала растворяли в ДМФА, а затем разводили в воде до концентрации 200 мкг/мл, также как для спектральных измерений. Раствор красителя добавляли в ячейку планшета с предварительно выращенным на покровном стекле монослоем клеток до конечной концентрации раствора 5 мкг/мл. Клетки инкубировали с красителем 30 мин в СО₂-инкубаторе, затем дважды отмывали свежей средой культивирования. Покровное стекло вынули из ячейки, положили на предметное стекло клетками между стекол и немедленно микроскопировали. Данный препарат необходимо быстро исследовать, до того как испарится питательная среда между стекол. На лазерном конфокальном инвертированном микроскопе «Nikon Eclipse TE2000», используя лазеры 405 (для фотоактивации) и 543 нм, микроскопировали полученный клеточный препарат.

Влияние рН. Спектры поглощения и флуоресценции растворов Род-813 концентрацией 5 мкг/мл при рН = 3, 7 и 11 изображены на рис. 2. При рН = 3 интенсивность поглощения и флуоресценции была больше, чем при рН = 7 и 11, причём прирост интенсивности флуоресценции при рН = 3 по сравнению с нейтральной и щелочной средой был больше, чем прирост поглощения, что указывает на больший квантовый выход Род-813 при кислом рН. При рН = 3 длина волны максимума поглощения была явно меньше (549 нм), чем при рН = 7 и 11 (554 и 553 нм). Разница между значениями длин волн максимума абсорбции при рН = 7 и 11 и между значениями длин волн максимумов флуоресценции для всех рН (значения максимумов находились в интервале 575-576 нм) сопоставима с приборной погрешностью (около 1 нм) и не является достоверной. Согласно структурной формуле Род-813, это соединение должно находиться при рН = 3 в катионной форме, а при рН = 11 - в цвиттерионной (рис. 1, б). Исходя из полученных данных, спектр цвиттериона смещён батохромно, что противоречит данным работы [8] для родамина В (формула на рис. 1, в). Но родамин В, в отличие от Род-813, имеет карбоксильную группу при сопряжённой системе (а у Род-813 она отделена от сопряжённой системы метиленовой группой), и, значит, протонирование-депротонирование данной группы Род-813 не окажет такое же влияние на спектральные свойства, какое оказывала в родамине В. В случае точечного детектирования флуоресценции в живых клетках этот эффект необходимо учитывать. Уменьшение внутриклеточного рН увеличивает интенсивность флуоресценции в клеточных препаратах.

Рис. 2. Спектр поглощения (1а) и флуоресценции (1б) при рН = 3; поглощения (2а) и флуоресценции (2б) при рН = 7; поглощения (3а) и флуоресценции (3б) при рН = 11

Концентрационное тушение. График на рис. 3 и данные, представленные в таблице, свидетельствуют в пользу того, что, как и родамину 6Ж (формула на рис. 1, в) [7], исследованному нами красителю присуще явление концентрационного тушения.

Линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации для Род-813 наблюдается вплоть до значений около (3 - 5)·10^-5 М (14-25 мкг/мл), далее рост замедляется; наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдается при концентрациях около 6,3·10^-5 М (30 мкг/мл). Далее она резко падает (рис. 3). Примерно до этих же концентраций наблюдается прямая пропорциональность между концентрацией и оптической плотностью, а далее наблюдается отклонение от закона Бугера-Ламберта-Бэра, что свидетельствует об образовании ассоциатов, ответственных за эффект концентрационного тушения [7]. Начиная с концентрации 10^-4 М (47 мкг/мл) максимум спектра флуоресценции сдвигается батохромно и в исследованном диапазоне концентраций доходит далее до 625 нм, что объясняется перекрыванием π-электронных облаков молекул, сопровождающемся увеличением степени делокализации электронов, а в сопряжённых системах это всегда приводит к батохромному сдвигу максимума флуоресценции. Труднее объяснить гипсохромный сдвиг спектра поглощения. Возможно, он вызван тем, что в ассоциатах может быть затруднён перенос зарядов от элетронодонорной к электроноакцепторной группе, часто сопровождающий процесс возбуждения [4, 6], что может приводить к затруднённости самого процесса возбуждения, необходимости большей энергии поглощаемого кванта для него. Ясно, что при окрашивании красителем ФФК-813 живых клеток нецелесообразно использовать количества красителя, создающие его конечную концентрацию в окрашиваемом материале более чем 6,3·10^-5 М (25-30 мкг/мл).

Спектральные свойства Род-813 при разных концентрациях красителя

Влияние вязкости. Влияние вязкости на интенсивность флуоресценции определяли в растворах глицерина разной концентрации. Поскольку коэффициент экстинкции красителя от вязкости не зависит, но фактически оптическая плотность в этих растворах менялась из-за разной растворимости соединения, то учитывалась эффективная интенсивность, рассчитанная как

где I_fl - приборная интенсивность флуоресценции; D - измеренное поглощение; D_nom - номинальное поглощение, наблюдавшееся в воде.

Согласно уравнению (1) зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости должна иметь вид прямой в логарифмических координатах, что и видно из рис. 4. При этом тангенс наклона полученной прямой, то есть постоянная «х», равная 0,141. Константа С = 4,179. Не очень большая величина х говорит об умеренной зависимости интенсивности флуоресценции от вязкости. При увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза. Окрашенные клетки линии А 431 представлены на микрофотографии с горизонтальной линией, по которой построен профиль интенсивности флуоресценции (рис. 5). Взяв из полученного спектра значения максимумов интенсивности флуоресценции и разделив на минимум, получаем в среднем от 5 до 10, т.е. во столько раз интенсивность флуоресценции ярких частей клеток отличаются от темных. Из вышеописанных экспериментов следует, что такая разница связана не только с селективностью окрашивания красителя определённых структур, но и с различными свойствами микроокружения (вязкости, рН).

рН среды влияет на интенсивность флуоресценции Род-813, которая в 1,5-2 раза больше у катионной формы по сравнению с цвиттерионной. Зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости подчиняется уравнению Фёрстера-Гофмана, при увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза.

Для красителя характерно концентрационное тушение с образованием малофлуоресцирующих ассоциатов, начиная с концентраций от 6,3×10^-5 М (30 мкг/мл), что необходимо учитывать при его практическом использовании для окрашивания клеток.

В разных участках живых клеток, окрашенных с помощью ФФК-813, интенсивность флуоресценции отличается между визуально яркими и темными внутриклеточными структурами в среднем от 5 до 10 раз, что обусловлено не только различной селективностью связывания красителя, но и неоднородностью параметров внутриклеточной среды.

• Белопухов С.Л., д.с.-х.н., к.х.н., профессор, заведующий кафедрой физической и коллоидной химии, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева», г. Москва;
• Клопов М.И., д.б.н., профессор кафедры химии, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, ГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный заочный университет», г. Балашиха.

Работа поступила в редакцию 23.07.2012.