Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НО-ШПАЛГИН И ПРОДУКТОВ ИХ БИОДЕСТРУКЦИИ В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЯХ РОДОКОККОВ

Вихарева Е.В. 1 Плотников А.Н. 1 Мухутдинова А.Н. 2 Мишенина И.И. 1 Поспелова А.А. 1 Тумилович Е.Ю. 1
1 ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России
2 ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН
Но-шпалгин – комплексное лекарственное средство спазмолитического и анальгезирующего действия, содержащее парацетамол, кодеина фосфат и дротаверина гидрохлорид. Научные статьи, посвященные одновременному обнаружению компонентов данного препарата в культуральной жидкости бактериальных культур, отсутствуют. В настоящей работе проведена идентификация парацетамола, кодеина фосфата, дротаверина гидрохлорида и продуктов их биологической деструкции при совместном присутствии в постферментационных культуральных средах родококков методом тонкослойной хроматографии. Разработан оптимальный состав системы растворителей, установлен наиболее эффективный способ детектирования и определены пределы обнаружения исследуемых веществ и продуктов их биодеструкции. Получена повторяемость (сходимость) измерений коэффициентов их подвижности в оптимальных системах растворителей. Показана возможность использования разработанной методики в лабораторных условиях при изучении механизмов разложения парацетамола, кодеина фосфата и дротаверина гидрохлорида, а также при разработке способов высокоэффективного удаления их из сточных вод.
Но-шпалгин
парацетамол
кодеина фосфат
дротаверина гидрохлорид
биологическая деструкция
актинобактерии рода Rhodococcus
тонкослойная хроматография
1. Акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768, www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html. Государственная Фармакопея РФ: в 2 ч. (2 часть). Общие методы анализа / МЗ и СР РФ. – 12-е изд., доп. – М.: Медицина, 2010. – C. 198–204.
2. Ившина И.Б., Рычкова М.И., Вихарева Е.В., Чекрышкина Л.А., Мишенина И.И. Деградация парацетамола с истекшим сроком годности свободными клетками актинобактерий // Катализ в промышленности. – 2006. – № 2. – С. 44–49.
3. Плотников А.Н., Тюмина Е.А., Рычкова М.И., Мишенина И.И., Вихарева Е.В., Ившина И.Б. Обнаружение кодеина в культуральных средах родококков методом тонкослойной хроматоргаии // Человек и лекарство: сб. материалов конгресса: ХХI Росс. Нац. Конгресс «» (Москва, 7–11 апреля 2014 г.). – М., 2014. – С. 308–309.
4. Регистр лекарственных средств России [Электронный ресурс]: официальный сайт. – Электрон.дан. – Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/ (дата обращения: 15.05.2014).
5. Ivshina I.B., Vikhareva E.V., Richkova M.I., Mukhutdinova A.N., Karpenko Ju.N. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2012. – Vol. 28. – P. 2997–3006.
6. Lee E., Lee S., Park J., Kim Y., Cho J. Removal and transformation of pharmaceuticals in wastewater treatment plants and constructed wetlands // Drink. Water Eng. Sci. Discuss. – 2013. – Vol. 6. – P. 89–98.
7. Lister D. L., Kanungo G., Rathbone D. A., Bruce N.C. Transformations of codeine to important semisynthetic opiate derivatives by Pseudomonas putida m10 // Microbiology Letters. – 1999. – Vol. 181. – P. 137–144.
8. The List of Species and Strains of IEGM Collection [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html (дата обращения: 10.03.2014).
9. Nikolaou A. Pharmaceuticals and related compounds as emerging pollutants in water: analytical aspects / A. Nikolaou // Global NEST Journal. – 2013. – Vol 15, № 1. – P. 1–12.

Но-шпалгин – комбинированное лекарственное средство, обладающее спазмолитическим и анальгезирующим действием [4]. Широкое использование парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата, являющихся компонентами данного препарата, неизбежно приводит к попаданию их в окружающую среду. В последнее время в почве и в водных источниках все чаще обнаруживаются лекарственные средства и их метаболиты. Попадающие в окружающую среду стабильные и биоактивные фармполлютанты оказывают хроническое воздействие на организм человека и способствуют нарушению экологического баланса [6, 9]. В ранее проведенных исследованиях показано, что биохимическое превращение парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата с использованием доминирующих в почвенных микробиоценозах актинобактерий рода Rhodococcus сопровождается образованием устойчивых метаболитов [2, 3, 5]. Следует отметить, что научные статьи, посвященные одновременной идентификации парацетамола, кодеина и дротаверина в культуральной жидкости бактериальных культур, отсутствуют. Поиск условий идентификации данных веществ предполагает разработку методики качественного анализа препарата Но-шпалгин в процессе его биологической деструкции.

Цель настоящего исследования – разработка методики идентификации компонентов комплексного лекарственного средства Но-шпалгин, а также продуктов их биологической деструкции в постферментационных культуральных средах родококков с использованием тонкослойной хроматографии.

Материалы и методы исследования

В работе использовали фармацевтические субстанции парацетамола (C8H9NO2, CAS: 103-90-2) («Аньцю Луань Фармасьютикал Ко., Лтд.», Китай), кодеина фосфата (C18H21NO3, CAS: 76-57-3) («Алкалибер С.А.», Испания), дротаверина гидрохлорида (C24Н31NO4, CAS: 985-12-6) (Ирбитский химико-фармацевтический завод, Россия) и комплексный препарат в виде готовой лекарственной формы (таблетки) Но-шпалгин (ЗАО «Хиноин», Будапешт, Венгрия), содержащий парацетамола 500 мг, дротаверина гидрохлорида 40 мг, кодеина фосфата (в форме гемигидрата) 8 мг.

Эксперименты по биодеструкции лекарственных средств проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл минерально-солевой среды RS [5], в условиях периодического культивирования (160 об/мин, 28 °С, pH 6,8) на орбитальной качалке Cetromat IS («Sartorius», Германия). Концентрации парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата составляли 200, 20 и 40 мг/л соответственно. В качестве биодеструктора дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата использовали штамм R. rhodochrous ИЭГМ 647, парацетамола – штамм R. erythropolis ИЭГМ 767 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768, [8]) [2, 3, 5]. Для биодеструкции Но-шпалгина использовали ассоциацию обоих штаммов. Посевным материалом служили клетки R. rhodochrous ИЭГМ 647, предварительно выращенные в присутствии низких концентраций дротаверина (2 мг/л) и кодеина (4 мг/л). Клетки штамма R. erythropolis ИЭГМ 767 выращивали в присутствии структурного аналога парацетамола – фенола (1000 мг/л). Продолжительность процесса биодеструкции парацетамола составила 20 сут, кодеина фосфата – 90 сут, дротаверина гидрохлорида – 25 сут, Но-шпалгина – 90 сут. В качестве контролей абиотической деструкции использовали стерильный раствор соединений в среде RS.

Пробы культуральных жидкостей для аналитических исследований (2 мл) в процессе биодеструкции лекарственных средств отбирали на 10 сут в случае парацетамола, на 15 сут – дротаверина гидрохлорида, 75 сут – кодеина фосфата и 30 сут – Но-шпалгина. Подготовку проб для анализа осуществляли посредством их центрифугирования при 10000 об/мин (MiniSpin Eppendorf, Германия) в течение 5 мин. Для хроматографического анализа дротаверина гидрохлорида использовали надосадочную жидкость (10 мкл), парацетамола и Но-шпалгина – осадок и надосадочную жидкость. В случае кодеина фосфата использовали хлороформенный экстракт надосадочной жидкости (pH 8,0).

При изучении хроматографической подвижности парацетамола и продуктов его биодеструкции исследовали 8 систем растворителей: 1П – хлороформ-ацетон (9:1); 2П – хлороформ – ацетон (8:2); 3П – гексан – этилацетат (85:15); 4П – диоксан – хлороформ – ацетон – раствор аммиака 25 % (47,5:45:5:2,5); 5П – этилацетат – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (17:2:1); 6П – хлороформ – спирт этиловый 95 % (7:3); 7П – толуол – ацетон – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5); 8П – хлороформ – спирт этиловый 95 % (8:2). В отношении кодеина фосфата и продуктов его биодеструкции апробировали 6 систем растворителей: 1К – толуол-ацетон-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5); 2К – толуол-спирт этиловый 95 % триэтиламин (9:1:1); 3К – этилацетат – спирт – этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (17:2:1); 4К – хлороформ – н-бутанол – раствор аммиака 25 % (70:40:15); 5К – хлороформ-спирт этиловый 95 % (9:1); 6К – хлороформ-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (9,5:0,5:1); 7К – хлороформ-метанол-раствор аммиака 25 % (9:0,9:0,1). Для разделения дротаверина гидрохлорида и продуктов его биодеструкции использовали 6 составов подвижных фаз: 1Д – хлороформ – спирт этиловый 95 % (80:20); 2Д – бензол – метанол – раствор аммиака 25 % (20:4:0,1); 3Д – бензол-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (80:10:0,1); 4Д – хлороформ – спирт этиловый 95 % ацетон (80:20:10); 5Д – хлороформ – спирт этиловый 95 % ацетон (80:10:5); 6Д – толуол – ацетон – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5).

Хроматографирование проводили на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ (ЗАО «Сорбполимер», Россия). Детекцию веществ осуществляли УФ облучением при длинах волн 254 и 365 нм, а также обработкой парами йода и реактивами Фреде, Эрдмана, Зонненшейна, Марки, Драгендорфа [1]. В качестве свидетелей лекарственных средств использовали растворы парацетамола 0,2 %, дротаверина гидрохлорида 0,002 % и кодеина фосфата 0,004 % в среде RS. Свидетелями продуктов разложения парацетамола являлись спиртовые растворы п-аминофенола, гидрохинона, бензохинона и пирокатехина (Merck, Германия), а продуктов биодеструкции дротаверина гидрохлорида – спиртовые растворы 3,4-диэтоксибензальдегида и 3,4-диэтоксибензойной кислоты (Merck, Германия).

Результаты исследования и их обсуждение

По нашим данным, наиболее эффективное разделение парацетамола и продуктов его биодеструкции наблюдалось в системах 1П, 7П и 8П (табл. 1).

Наиболее чувствительным детектором парацетамола и его метаболитов являлся УФ свет при длине волны 365 нм (предел обнаружения парацетамола УФ светом в системе 8П – 2,5 мкг/мкл, при обработке парами йода – 5 мкг/мкл).

Таблица 1

Значения величин Rf×100 парацетамола и продуктов его биодеструкции в культуральной среде R. erythropolis ИЭГМ 767

Исследуемые вещества

Система растворителей

Парацетамол

18

33

41

63

78

74

51

55

п-Аминофенол

16

34

38

71

81

82

53

51

Гидрохинон

59

63

49

83

94

77

69

60

Бензохинон

46

66

57

82

82

64

58

Пирокатехин

43

68

83

84

82

61

73

Неидентифицированный продукт биодеструкции

29

12

11

81

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

Эффективное разделение кодеина фосфата и продуктов его биодеструкции наблюдалось в системах 1К, 3К, 7К (табл. 2). Предел обнаружения кодеина фосфата в данных системах: при облучении УФ светом с длиной волны 365 нм – 1 мкг/мл, при обработке парами йода – 2 мкг/мл, при обработке реактивом Драгендорфа – 0,5 мкг/мл. Несмотря на высокую чувствительность в отношении кодеина, реактив Драгендорфа не позволяет идентифицировать большинство продуктов биодеструкции данного вещества. Поэтому рациональным является использование комбинированного детектирования: облучение УФ светом при длине волны 365 нм с последующей обработкой пластин реактивом Драгендорфа. Поскольку система 7К по сравнению с системами 1К и 3К позволяет обнаружить наибольшее количество продуктов биодеструкции кодеина, два из которых, согласно данным Lister D.L., Kanungo G. и др. [7], представляют собой 14-гидроксикодеинон (Rf×100 = 53) и дигидрокодеин (Rf×100 = 23), ее можно считать оптимальной для дальнейшего изучения параметров удерживания кодеина и продуктов его биодеструкции.

Таблица 2

Значения величин Rf×100 кодеина фосфата и продуктов его биодеструкции в культуральной среде R. rhodochrous ИЭГМ 647

Исследуемые вещества

Система растворителей

Кодеина фосфат

34

44

23

63

28

44

36

Продукты биодеструкции

25

19; 41

15;23;29;53

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

Наиболее селективными системами, позволяющими разделить продукты биодеструкции дротаверина гидрохлорида, являлись 1Д, 3Д и 6Д (табл. 3).

Таблица 3

Значения величин Rf×100 дротаверина гидрохлорида и продуктов его биодеструкции в культуральной среде R. rhodochrous ИЭГМ 647

Исследуемые вещества

Система растворителей

Дротаверина гидрохлорид

71

32

25

65

53

75

3,4-Диэтоксибензальдегид

80

78

3,4-Диэтоксибензойная кислота

90

88

Неидентифицированный продукт биодеструкции

80

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

Предел обнаружения дротаверина гидрохлорида в данных системах составил 2 мкг/мл при детектировании УФ светом (длина волны 365 нм), парами йода и реактивом Драгендорфа. Однако предпочтительно использовать УФ свет, так как данный способ, в отличие от других, наряду с дротаверином позволяет обнаружить продукты его биодеструкции.

Для определения парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата как компонентов препарата Но-шпалгин, а также продуктов их биологической деструкции в культуральных средах родококков использовали 3 системы растворителей (табл. 4), выбранные в качестве оптимальных: 1Н – хлороформ – спирт этиловый 95 % (80:20); 2Н – этилацетат-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (17:2:1); 3Н – толуол – ацетон – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5).

Таблица 4

Значения Rf×100 компонентов Но-шпалгина и продуктов их биодеструкции в культуральных средах R. rhodochrous ИЭГМ 647 и R. erythropolis ИЭГМ 767

Объекты исследования

Подвижная фаза

Значения Rf×100 компонентов препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции

Парацетамол

55

78

51

Продукты биодеструкции

13, 58, 60, 73, 81

81, 82, 84, 94

11, 53, 64, 61, 69

Дротаверина гидрохлорид

51

13

75

Продукты биодеструкции

22

5, 88

5, 15, 90

Кодеина фосфат

32

23

34

Продукты биодеструкции

19, 41

25, 43, 48, 71

Неидентифицированные продукты биодеструкции препарата Но-шпалгин

80, 86

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

По нашим данным, оптимальной системой для разделения компонентов препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции является система 3Н (табл. 5, рисунок). Детектор – УФ свет при длине волны 365 нм. Анализ продуктов биодеструкции парацетамола в данной системе растворителей позволил обнаружить, помимо парацетамола (Rf×100 = 51), п-аминофенол (Rf×100 = 53), бензохинон (Rf×100 = 64), гидрохинон (Rf×100 = 69) и два неидентифицированных вещества (Rf×100 = 61 и Rf×100 = 11). Среди продуктов биодеструкции дротаверина гидрохлорида, помимо дротаверина (Rf×100 = 75), обнаружены соединения: 3,4-диэтоксибензальдегид (Rf×100 = 90), 3,4-диэтоксибензойная кислота (Rf×100 = 5) и неидентифицированное вещество (Rf×100 = 15). В качестве продуктов биодеструкции кодеина фосфата в культуральной жидкости родококков, помимо кодеина (Rf×100 = 34), присутствовало четыре неидентифицированных вещества с Rf×100: 25; 43; 48; 71. Кроме того, в культуральной среде обнаружены два неидентифицированных соединения с Rf×100: 80 и 86.

Хроматографическую подвижность парацетамола, кодеина фосфата, дротаверина гидрохлорида и продуктов их биодеструкции как таковых, а также при совместном присутствии в составе комплексного препарата Но-шпалгин изучали в трехкратной повторности в выбранных оптимальных системах растворителей (табл. 5). Результаты параллельных определений считали сходимыми (repeatability) при условии:

│X1 - Xn│ < L(P, m)∙S. [1].

Данные табл. 6 свидетельствуют о повторяемости (сходимости) измерений коэффициентов подвижности парацетамола, кодеина фосфата, дротаверина гидрохлорида, препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции в оптимальных системах растворителей.

pic_48.wmf

Хроматографическое поведение компонентов препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции в культуральных средах родококков в системе 3Н: I – свидетели парацетамола и продуктов его биодеструкции: 1 – парацетамол; 2 – пирокатехин; 3 – гидрохинон; 4 – бензохинон; 5 – п-аминофенол; II – свидетели дротаверина гидрохлорида и продуктов его биодеструкции: 6 – дротаверина гидрохлорид; 7 – 3;4-диэтоксибензальдегид; 8 – 3;4-диэтоксибензойная кислота; III – свидетель кодеина фосфата (9); IV – культуральная жидкость, содержащая Но-шпалгин и продукты его биодеструкции (10); * – неидентифицированные продукты биодеструкции (Rf×100: 11; 15; 25; 48; 80)

Таблица 5

Оценка повторяемости результатов параллельных определений коэффициентов подвижности компонентов препарата «Но-шпалгин» и продуктов их биодеструкции

Исследуемые вещества

Метрологические характеристики (m = 3, Р = 95 %, L = 3,31)

X1

X2

X3

vihareva01.wmf

S

L×S

1

2

3

4

5

6

7

Парацетамол и продукты биодеструкции, система 8П

Парацетамол

55

55

54

54,67

0,46

1,52

п-Аминофенол

51

50

52

51,00

1,0

3,31

Гидрохинон

60

59

59

59,33

0,96

3,18

Бензохинон

58

57

58

57,67

0,49

1,62

Пирокатехин

73

74

71

72,67

1,26

4,17

Неидентифицированный продукт биодеструкции

81

81

80

80,67

0,69

2,28

Кодеина фосфат и продукты биодеструкции, система 7К

Кодеина фосфат

36

36

36

36,0

0

0

14-Гидроксикодеинон

53

53

54

53,33

0,93

3,07

Продукт биодеструкции № 1

28

28

26

27,33

1,15

3,80

Дигидрокодеин

23

23

23

23,0

0

0

Продукт биодеструкции № 2

15

15

14

14,67

0,58

1,92

Дротаверина гидрохлорид и продукты биодеструкции, система 1Д

Дротаверина гидрохлорид

71

71

70

70,67

0,61

2,02

3,4-Диэтоксибензальдегид

91

90

89

90

1,0

3,31

3,4-Диэтоксибензойная кислота

80

80

79

79,67

0,68

2,25

Дротаверина гидрохлорид

71

71

70

70,67

0,61

2,02

1

2

3

4

5

6

7

Препарат Но-шпалгин, система 3Н

Парацетамол

61

61

60

60,67

0,52

1,72

Кодеина фосфат

34

34

32

33,33

1,29

4,27

Дротаверина гидрохлорид

74

74

75

74,33

0,58

1,92

Примечания: Хn – экспериментально полученное значение Rf×100; vihareva02.wmf – среднее значение; S – стандартное отклонение; L – фактор, вычисленный по Пирсону L(P; m) при Р = 95 % [1].

Заключение

Установлены оптимальные условия идентификации парацетамола, дротаверина гидрохлорида, кодеина фосфата и продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях родококков методом тонкослойной хроматографии. Получена повторяемость (сходимость) измерений коэффициентов подвижности исследуемых веществ. Показана возможность использования разработанной методики для идентификации компонентов комплексного лекарственного средства Но-шпалгин в культуральной жидкости родококков. Относительная простота и экспрессность методики обеспечивают ее использование в лабораторных условиях при изучении механизмов разложения лекарственных средств, а также при разработке способов высокоэффективного удаления их из сточных вод.

Рецензенты:

Хомов Ю.А., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической химии ФЗО и ФДПО, ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь;

Михайловский А.Г., д.фарм.н., профессор кафедры общей и органической химии, ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь.

Работа поступила в редакцию 15.07.2014.


Библиографическая ссылка

Вихарева Е.В., Плотников А.Н., Мухутдинова А.Н., Мишенина И.И., Поспелова А.А., Тумилович Е.Ю. ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НО-ШПАЛГИН И ПРОДУКТОВ ИХ БИОДЕСТРУКЦИИ В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЯХ РОДОКОККОВ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9-5. – С. 1032-1037;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35011 (дата обращения: 06.08.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074