Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Вихарева Е.В. 1 Плотников А.Н. 1 Мухутдинова А.Н. 2 Мишенина И.И. 1 Поспелова А.А. 1 Тумилович Е.Ю. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России

2 ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН

Но-шпалгин – комплексное лекарственное средство спазмолитического и анальгезирующего действия, содержащее парацетамол, кодеина фосфат и дротаверина гидрохлорид. Научные статьи, посвященные одновременному обнаружению компонентов данного препарата в культуральной жидкости бактериальных культур, отсутствуют. В настоящей работе проведена идентификация парацетамола, кодеина фосфата, дротаверина гидрохлорида и продуктов их биологической деструкции при совместном присутствии в постферментационных культуральных средах родококков методом тонкослойной хроматографии. Разработан оптимальный состав системы растворителей, установлен наиболее эффективный способ детектирования и определены пределы обнаружения исследуемых веществ и продуктов их биодеструкции. Получена повторяемость (сходимость) измерений коэффициентов их подвижности в оптимальных системах растворителей. Показана возможность использования разработанной методики в лабораторных условиях при изучении механизмов разложения парацетамола, кодеина фосфата и дротаверина гидрохлорида, а также при разработке способов высокоэффективного удаления их из сточных вод.

Статья в формате PDF

383 KB

Но-шпалгин

парацетамол

кодеина фосфат

дротаверина гидрохлорид

биологическая деструкция

актинобактерии рода Rhodococcus

тонкослойная хроматография

1. Акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768, www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html. Государственная Фармакопея РФ: в 2 ч. (2 часть). Общие методы анализа / МЗ и СР РФ. – 12-е изд., доп. – М.: Медицина, 2010. – C. 198–204.

2. Ившина И.Б., Рычкова М.И., Вихарева Е.В., Чекрышкина Л.А., Мишенина И.И. Деградация парацетамола с истекшим сроком годности свободными клетками актинобактерий // Катализ в промышленности. – 2006. – № 2. – С. 44–49.

3. Плотников А.Н., Тюмина Е.А., Рычкова М.И., Мишенина И.И., Вихарева Е.В., Ившина И.Б. Обнаружение кодеина в культуральных средах родококков методом тонкослойной хроматоргаии // Человек и лекарство: сб. материалов конгресса: ХХI Росс. Нац. Конгресс «» (Москва, 7–11 апреля 2014 г.). – М., 2014. – С. 308–309.

4. Регистр лекарственных средств России [Электронный ресурс]: официальный сайт. – Электрон.дан. – Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/ (дата обращения: 15.05.2014).

5. Ivshina I.B., Vikhareva E.V., Richkova M.I., Mukhutdinova A.N., Karpenko Ju.N. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2012. – Vol. 28. – P. 2997–3006.

6. Lee E., Lee S., Park J., Kim Y., Cho J. Removal and transformation of pharmaceuticals in wastewater treatment plants and constructed wetlands // Drink. Water Eng. Sci. Discuss. – 2013. – Vol. 6. – P. 89–98.

7. Lister D. L., Kanungo G., Rathbone D. A., Bruce N.C. Transformations of codeine to important semisynthetic opiate derivatives by Pseudomonas putida m10 // Microbiology Letters. – 1999. – Vol. 181. – P. 137–144.

8. The List of Species and Strains of IEGM Collection [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html (дата обращения: 10.03.2014).

9. Nikolaou A. Pharmaceuticals and related compounds as emerging pollutants in water: analytical aspects / A. Nikolaou // Global NEST Journal. – 2013. – Vol 15, № 1. – P. 1–12.

Но-шпалгин – комбинированное лекарственное средство, обладающее спазмолитическим и анальгезирующим действием [4]. Широкое использование парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата, являющихся компонентами данного препарата, неизбежно приводит к попаданию их в окружающую среду. В последнее время в почве и в водных источниках все чаще обнаруживаются лекарственные средства и их метаболиты. Попадающие в окружающую среду стабильные и биоактивные фармполлютанты оказывают хроническое воздействие на организм человека и способствуют нарушению экологического баланса [6, 9]. В ранее проведенных исследованиях показано, что биохимическое превращение парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата с использованием доминирующих в почвенных микробиоценозах актинобактерий рода Rhodococcus сопровождается образованием устойчивых метаболитов [2, 3, 5]. Следует отметить, что научные статьи, посвященные одновременной идентификации парацетамола, кодеина и дротаверина в культуральной жидкости бактериальных культур, отсутствуют. Поиск условий идентификации данных веществ предполагает разработку методики качественного анализа препарата Но-шпалгин в процессе его биологической деструкции.

Цель настоящего исследования – разработка методики идентификации компонентов комплексного лекарственного средства Но-шпалгин, а также продуктов их биологической деструкции в постферментационных культуральных средах родококков с использованием тонкослойной хроматографии.

Материалы и методы исследования

В работе использовали фармацевтические субстанции парацетамола (C₈H₉NO₂, CAS: 103-90-2) («Аньцю Луань Фармасьютикал Ко., Лтд.», Китай), кодеина фосфата (C₁₈H₂₁NO_3, CAS: 76-57-3) («Алкалибер С.А.», Испания), дротаверина гидрохлорида (C₂₄Н₃₁NO₄, CAS: 985-12-6) (Ирбитский химико-фармацевтический завод, Россия) и комплексный препарат в виде готовой лекарственной формы (таблетки) Но-шпалгин (ЗАО «Хиноин», Будапешт, Венгрия), содержащий парацетамола 500 мг, дротаверина гидрохлорида 40 мг, кодеина фосфата (в форме гемигидрата) 8 мг.

Эксперименты по биодеструкции лекарственных средств проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл минерально-солевой среды RS [5], в условиях периодического культивирования (160 об/мин, 28 °С, pH 6,8) на орбитальной качалке Cetromat IS («Sartorius», Германия). Концентрации парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата составляли 200, 20 и 40 мг/л соответственно. В качестве биодеструктора дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата использовали штамм R. rhodochrous ИЭГМ 647, парацетамола – штамм R. erythropolis ИЭГМ 767 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768, [8]) [2, 3, 5]. Для биодеструкции Но-шпалгина использовали ассоциацию обоих штаммов. Посевным материалом служили клетки R. rhodochrous ИЭГМ 647, предварительно выращенные в присутствии низких концентраций дротаверина (2 мг/л) и кодеина (4 мг/л). Клетки штамма R. erythropolis ИЭГМ 767 выращивали в присутствии структурного аналога парацетамола – фенола (1000 мг/л). Продолжительность процесса биодеструкции парацетамола составила 20 сут, кодеина фосфата – 90 сут, дротаверина гидрохлорида – 25 сут, Но-шпалгина – 90 сут. В качестве контролей абиотической деструкции использовали стерильный раствор соединений в среде RS.

Пробы культуральных жидкостей для аналитических исследований (2 мл) в процессе биодеструкции лекарственных средств отбирали на 10 сут в случае парацетамола, на 15 сут – дротаверина гидрохлорида, 75 сут – кодеина фосфата и 30 сут – Но-шпалгина. Подготовку проб для анализа осуществляли посредством их центрифугирования при 10000 об/мин (MiniSpin Eppendorf, Германия) в течение 5 мин. Для хроматографического анализа дротаверина гидрохлорида использовали надосадочную жидкость (10 мкл), парацетамола и Но-шпалгина – осадок и надосадочную жидкость. В случае кодеина фосфата использовали хлороформенный экстракт надосадочной жидкости (pH 8,0).

При изучении хроматографической подвижности парацетамола и продуктов его биодеструкции исследовали 8 систем растворителей: 1П – хлороформ-ацетон (9:1); 2П – хлороформ – ацетон (8:2); 3П – гексан – этилацетат (85:15); 4П – диоксан – хлороформ – ацетон – раствор аммиака 25 % (47,5:45:5:2,5); 5П – этилацетат – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (17:2:1); 6П – хлороформ – спирт этиловый 95 % (7:3); 7П – толуол – ацетон – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5); 8П – хлороформ – спирт этиловый 95 % (8:2). В отношении кодеина фосфата и продуктов его биодеструкции апробировали 6 систем растворителей: 1К – толуол-ацетон-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5); 2К – толуол-спирт этиловый 95 % триэтиламин (9:1:1); 3К – этилацетат – спирт – этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (17:2:1); 4К – хлороформ – н-бутанол – раствор аммиака 25 % (70:40:15); 5К – хлороформ-спирт этиловый 95 % (9:1); 6К – хлороформ-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (9,5:0,5:1); 7К – хлороформ-метанол-раствор аммиака 25 % (9:0,9:0,1). Для разделения дротаверина гидрохлорида и продуктов его биодеструкции использовали 6 составов подвижных фаз: 1Д – хлороформ – спирт этиловый 95 % (80:20); 2Д – бензол – метанол – раствор аммиака 25 % (20:4:0,1); 3Д – бензол-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (80:10:0,1); 4Д – хлороформ – спирт этиловый 95 % ацетон (80:20:10); 5Д – хлороформ – спирт этиловый 95 % ацетон (80:10:5); 6Д – толуол – ацетон – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5).

Хроматографирование проводили на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ (ЗАО «Сорбполимер», Россия). Детекцию веществ осуществляли УФ облучением при длинах волн 254 и 365 нм, а также обработкой парами йода и реактивами Фреде, Эрдмана, Зонненшейна, Марки, Драгендорфа [1]. В качестве свидетелей лекарственных средств использовали растворы парацетамола 0,2 %, дротаверина гидрохлорида 0,002 % и кодеина фосфата 0,004 % в среде RS. Свидетелями продуктов разложения парацетамола являлись спиртовые растворы п-аминофенола, гидрохинона, бензохинона и пирокатехина (Merck, Германия), а продуктов биодеструкции дротаверина гидрохлорида – спиртовые растворы 3,4-диэтоксибензальдегида и 3,4-диэтоксибензойной кислоты (Merck, Германия).

Результаты исследования и их обсуждение

По нашим данным, наиболее эффективное разделение парацетамола и продуктов его биодеструкции наблюдалось в системах 1П, 7П и 8П (табл. 1).

Наиболее чувствительным детектором парацетамола и его метаболитов являлся УФ свет при длине волны 365 нм (предел обнаружения парацетамола УФ светом в системе 8П – 2,5 мкг/мкл, при обработке парами йода – 5 мкг/мкл).

Таблица 1

Значения величин Rf×100 парацетамола и продуктов его биодеструкции в культуральной среде R. erythropolis ИЭГМ 767

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

Эффективное разделение кодеина фосфата и продуктов его биодеструкции наблюдалось в системах 1К, 3К, 7К (табл. 2). Предел обнаружения кодеина фосфата в данных системах: при облучении УФ светом с длиной волны 365 нм – 1 мкг/мл, при обработке парами йода – 2 мкг/мл, при обработке реактивом Драгендорфа – 0,5 мкг/мл. Несмотря на высокую чувствительность в отношении кодеина, реактив Драгендорфа не позволяет идентифицировать большинство продуктов биодеструкции данного вещества. Поэтому рациональным является использование комбинированного детектирования: облучение УФ светом при длине волны 365 нм с последующей обработкой пластин реактивом Драгендорфа. Поскольку система 7К по сравнению с системами 1К и 3К позволяет обнаружить наибольшее количество продуктов биодеструкции кодеина, два из которых, согласно данным Lister D.L., Kanungo G. и др. [7], представляют собой 14-гидроксикодеинон (Rf×100 = 53) и дигидрокодеин (Rf×100 = 23), ее можно считать оптимальной для дальнейшего изучения параметров удерживания кодеина и продуктов его биодеструкции.

Таблица 2

Значения величин Rf×100 кодеина фосфата и продуктов его биодеструкции в культуральной среде R. rhodochrous ИЭГМ 647

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

Наиболее селективными системами, позволяющими разделить продукты биодеструкции дротаверина гидрохлорида, являлись 1Д, 3Д и 6Д (табл. 3).

Таблица 3

Значения величин Rf×100 дротаверина гидрохлорида и продуктов его биодеструкции в культуральной среде R. rhodochrous ИЭГМ 647

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

Предел обнаружения дротаверина гидрохлорида в данных системах составил 2 мкг/мл при детектировании УФ светом (длина волны 365 нм), парами йода и реактивом Драгендорфа. Однако предпочтительно использовать УФ свет, так как данный способ, в отличие от других, наряду с дротаверином позволяет обнаружить продукты его биодеструкции.

Для определения парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата как компонентов препарата Но-шпалгин, а также продуктов их биологической деструкции в культуральных средах родококков использовали 3 системы растворителей (табл. 4), выбранные в качестве оптимальных: 1Н – хлороформ – спирт этиловый 95 % (80:20); 2Н – этилацетат-спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (17:2:1); 3Н – толуол – ацетон – спирт этиловый 95 % раствор аммиака 25 % (45:45:7,5:2,5).

Таблица 4

Значения Rf×100 компонентов Но-шпалгина и продуктов их биодеструкции в культуральных средах R. rhodochrous ИЭГМ 647 и R. erythropolis ИЭГМ 767

Примечание. «–» зона вещества не обнаружена.

По нашим данным, оптимальной системой для разделения компонентов препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции является система 3Н (табл. 5, рисунок). Детектор – УФ свет при длине волны 365 нм. Анализ продуктов биодеструкции парацетамола в данной системе растворителей позволил обнаружить, помимо парацетамола (Rf×100 = 51), п-аминофенол (Rf×100 = 53), бензохинон (Rf×100 = 64), гидрохинон (Rf×100 = 69) и два неидентифицированных вещества (Rf×100 = 61 и Rf×100 = 11). Среди продуктов биодеструкции дротаверина гидрохлорида, помимо дротаверина (Rf×100 = 75), обнаружены соединения: 3,4-диэтоксибензальдегид (Rf×100 = 90), 3,4-диэтоксибензойная кислота (Rf×100 = 5) и неидентифицированное вещество (Rf×100 = 15). В качестве продуктов биодеструкции кодеина фосфата в культуральной жидкости родококков, помимо кодеина (Rf×100 = 34), присутствовало четыре неидентифицированных вещества с Rf×100: 25; 43; 48; 71. Кроме того, в культуральной среде обнаружены два неидентифицированных соединения с Rf×100: 80 и 86.

Хроматографическую подвижность парацетамола, кодеина фосфата, дротаверина гидрохлорида и продуктов их биодеструкции как таковых, а также при совместном присутствии в составе комплексного препарата Но-шпалгин изучали в трехкратной повторности в выбранных оптимальных системах растворителей (табл. 5). Результаты параллельных определений считали сходимыми (repeatability) при условии:

│X₁ - X_n│ < L(P, m)∙S. [1].

Данные табл. 6 свидетельствуют о повторяемости (сходимости) измерений коэффициентов подвижности парацетамола, кодеина фосфата, дротаверина гидрохлорида, препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции в оптимальных системах растворителей.

Хроматографическое поведение компонентов препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции в культуральных средах родококков в системе 3Н: I – свидетели парацетамола и продуктов его биодеструкции: 1 – парацетамол; 2 – пирокатехин; 3 – гидрохинон; 4 – бензохинон; 5 – п-аминофенол; II – свидетели дротаверина гидрохлорида и продуктов его биодеструкции: 6 – дротаверина гидрохлорид; 7 – 3;4-диэтоксибензальдегид; 8 – 3;4-диэтоксибензойная кислота; III – свидетель кодеина фосфата (9); IV – культуральная жидкость, содержащая Но-шпалгин и продукты его биодеструкции (10); * – неидентифицированные продукты биодеструкции (Rf×100: 11; 15; 25; 48; 80)

Таблица 5

Оценка повторяемости результатов параллельных определений коэффициентов подвижности компонентов препарата «Но-шпалгин» и продуктов их биодеструкции

Примечания: Хn – экспериментально полученное значение Rf×100;  – среднее значение; S – стандартное отклонение; L – фактор, вычисленный по Пирсону L(P; m) при Р = 95 % [1].

Заключение

Установлены оптимальные условия идентификации парацетамола, дротаверина гидрохлорида, кодеина фосфата и продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях родококков методом тонкослойной хроматографии. Получена повторяемость (сходимость) измерений коэффициентов подвижности исследуемых веществ. Показана возможность использования разработанной методики для идентификации компонентов комплексного лекарственного средства Но-шпалгин в культуральной жидкости родококков. Относительная простота и экспрессность методики обеспечивают ее использование в лабораторных условиях при изучении механизмов разложения лекарственных средств, а также при разработке способов высокоэффективного удаления их из сточных вод.

Рецензенты:

Хомов Ю.А., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической химии ФЗО и ФДПО, ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь;

Михайловский А.Г., д.фарм.н., профессор кафедры общей и органической химии, ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь.

Работа поступила в редакцию 15.07.2014.

Библиографическая ссылка