Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Ермолаева Е.Н. 1 Кривохижина Л.В. 1 Кантюков С.А. 1 Яковлева В.П. 2

---

1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

2 ФГБОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры»

Тромбоциты рассматриваются как источники гуморальных факторов, стимулирующих одновременно процессы гемостаза и воспаления. В эксперименте рассматривается влияние белка «острой фазы» – церулоплазмина на функцию тромбоцитов. Церулоплазмин вводили интактным крысам однократно в дозе 50 % от физиологического уровня, что соответствует его повышению при остром воспалении. Результаты оценивали через 12 часов, на 1, 3-е и 8-е сутки после введения препарата. Церулоплазмин способствовал уменьшению ретенционной и агрегационной способности тромбоцитов: снизилась максимальная амплитуда и скорость агрегации и высвобождение тромбоцитарных факторов Р3 и Р4 с 12 часов до 8 суток. На 24 ч после введения церулоплазмина снизилась АДФ-индуцированная хемилюминесценция тромбоцитов крыс. Таким образом, белок острой фазы церулоплазмин обладает способностью снижать проагрегантные свойства тромбоцитов, что может расцениваться как наличие обратной связи в реализации процесса воспаления.

Статья в формате PDF

291 KB

тромбоциты

церулоплазмин

белок острой фазы

1. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. – Томск: Медицина, 1980. – 310 с.

2. Ермолаева Е.Н., Кривохижина Л.В., Кантюков С.А., Сергиенко В.А. Механизмы антиагрегационного действия церулоплазмина // Эфферентная терапия. – 2004. – Т. 10, № 4. – С. 39–42.

3. Пат. 2230322 РФ Способ обнаружения свечения тромбоцитов / Исаев А.П., Кривохижина Л.В., Кантюков С.А., Ермолаева Е.Н., Курилов И.Н. – М., 2004. – 5 с.

4. Комаров А.Л., Панченко Е.П. Роль воспаления в развитии атеротромбоза. Противоспалительные эффекты клопидогреля // Фарматека. – 2007. – № 8/9. – С. 23–29.

5. Bhatt DI, Topol EJ. Scientific and therapeutic advances in antiplatelet therapy // Nat Rev Drug Discov. – 2003. – Т. 2. – Р. 15–28.

6. Chew D.P. et al. Effect of clopidogrel added to aspirin before percutaneous coronary intervention on the risk associated with C-reactive protein // Am J Cardiol. – 2001. – Т. 88. – Р. 672–674.

7. Christopher M. Scull, William D. Hays, and Thomas H. Fischer. Macrophage pro-inflammatory cytokine secretion is enhanced following interaction with autologous platelets // J Inflamm (Lond). – 2010. – Т. 7. – Р. 53.

8. Ellinor I. Peerschke, Wei Yin and Berhane Ghebrehiwet. Complement Activation on Platelets: Implications for Vascular Inflammation and Thrombosis // Mol Immunol. – 2010. – Т. 47(13). – Р. 2170–2175.

9. Henn V. et al. CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction of endothelial cells // Nature. – 1998. – Т. 391. – Р. 591–594.

10. Lindemann S., et al. Activated platelets mediate inflammatory signaling by regulated interleukin 1-synthesis // J Cell Biol. – 2001. – Т. 154. – Р. 485–490.

11. Neumann F.J. et al. Induction of cytokine expression in leukocytes by binding of thrombin – stimulated platelets // Circulation. – 1997. – Т. 95. – Р. 2387–2394.

12. Schonbeck U., Libby P. CD40 Signaling and Plaque Instability // Circ Res. – 2001. – Т. 89. – Р. 1092–1103.

13. Shyder S. Serum complement levels in hyperlipidemic subjects with or without vascular disease // Fed. Proc. – 1974. – Vol. 33. – P. 229–231.

14. Topol E.J., Serruys P.W. Frontiers in interventional cardiology // Circulation. – 1998. – Т. 98. – Р. 1802–1820.

15. Foreman J.C. Neuropeptides and the pathogenesis of allergy // Allergy. – 1987. – Vol. 42, № 1. – P. 1–11.

На сегодняшний день тромбоциты рассматриваются как источники гуморальных факторов, стимулирующих одновременно процессы гемостаза и воспаления [14]. Наличие в тромбоцитах м-РНК для синтеза – предшественника ИЛ-1β, каспаз, остеонектина, виментина, убихитина, тканевого ингибитора матриксной металло-протеиназы I типа свидетельствуют о многогранной роли тромбоцитов в процессе воспаления [4]. В α-гранулах тромбоцитов содержатся модуляторы воспаления, такие как Р-селектин, тромбоспондин-1, 4-й фактор тромбоцитов, трансформирующий фактор роста β и RANTES (регуляторы активации процессов экспрессии и секреции нормальных Т-лимфоцитов).

Транскрипторный аппарат тромбоцитов состоит в основном из м-РНК, кодирующей воспалительные белки [5]. Активация тромбоцитов приводит к экспрессии на их поверхности Р-селектина и увеличению интенсивности тромбоцитарно-лейкоцитарной адгезии на эндотелий и циркулирующих тромбоцитарно-моноцитарных агрегатов [9]. Следствием взаимодействия макрофагов с аутологичными тромбоцитами является повышение их провоспалительных свойств [10]. Центральная роль в обеспечении межклеточных взаимодействий принадлежит сигнальной системе – рецептор CD40 и его лиганд – CD40L [9]. Более 90 % CD40L имеют тромбоцитарное происхождение [9]. Наличие на тромбоцитах лиганда CD40 (CD40L) к CD40 позволяет тромбоцитам присоединяться к макрофагам, Т-лимфоцитам и эндотелиальным клеткам. После отсоединения CD40L от поверхности тромбоцита он активирует каскад воспалительных реакций, в который вовлечены такие белки, как Е-селектин, VCAM и ICAM.

Тромбоциты способны экспрессировать внутренние факторы, запускающие как классический, так и альтернативный путь активации комплемента. Подобная активация клеток ‒ следствие действия биохимических агонистов и (или) напряжения сдвига и связана с экспрессией P-селектина, gC1qR и хондроитина сульфата. Тромбоцит как посредник активации комплемента в известной мере увеличивает растворимые воспалительные медиаторы (C3a и C5a) [8].

Другими участниками одновременно тромботического и воспалительного процессов являются высвобождаемые активированными тромбоцитами микрочастицы (PDMP). PDMP принимают участие в адгезии тромбоцитов к поврежденному эндотелию, путем экспрессии Р-селектина, PDMP способствуют агрегации лейкоцитов.

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что белки острой фазы воспаления прямо или опосредованно могут влиять на тромбоциты, изменяя их функциональное состояние.

Цель исследования – определить наличие и механизмы влияния белка острой фазы – церулоплазмина ‒ на функциональное состояние тромбоцитов.

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на 50 половозрелых белых беспородных крысах-самцах массой 180–200 г. Все исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977. Забор крови осуществлялся внутрисердечно, согласно правилам гемостазиологических исследований [1]. Церулоплазмин (ЦП) вводили однократно, внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг веса животного, что составляет 50 % от его физиологического уровня в сыворотке крови крыс. В экспериментах использовался препарат «Церулоплазмин» (НПО «Иммунопрепарат», Уфа). Сроки исследования – 12 часов, 3 и 8 сутки. Ретенцию тромбоцитов оценивали по их способности прилипать к стеклянной поверхности. Способность тромбоцитов к агрегации определяли по методу Борна. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ в конечной концентрации 7∙10–7 М. Агрегационная способность тромбоцитов оценивалась по: лаг-периоду; времени, скорости, максимальной амплитуде. Фактор Р3 определяли по разнице показателей АВР плазмы до и после удаления тромбоцитов из нее по Rabiner, Groder. Фактор Р4 плазмы определяли по действию прогретой БТП на тромбин-гепариновое время свертывания субстратной плазмы [1].

Способность тромбоцитов к продукции свободных радикалов оценивали методом хемилюминесценции [3]. Интенсивность свободнорадикального окисления в тромбоцитах исследовали методом хемилюминесценции с использованием хемилюминометра ХЛ-003. Объем пробы составлял 5 мл обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) с концентрацией клеток 300000 в мкл, использовали медленное перемешивание, температурный режим – 37 °С, время регистрации 30 минут. Интенсивность хемилюминесценции тромбоцитов исследовали в присутствии люминола, так как это соединение, вступающее в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ анализа данных Statistica 6.0, использован непараметрический критерий Манна ‒ Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Однократное введение ЦП крысам в дозе 50 % от физиологического уровня, что соответствует его повышению при остром воспалении, приводило к снижению ретенционной способности тромбоцитов на весьма длительное время (табл. 1).

Таблица 1

Влияние церулоплазмина на ретенцию тромбоцитов (M ± m)

Примечания: n – число наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.

Под влиянием ЦП изменялась агрегационная способность тромбоцитов, это касалось снижения максимальной амплитуды и скорости агрегации с 12 часов до 8 суток после однократного введения. Удлинение лаг-периода отмечено лишь на 12 час (табл. 2).

Снижалась реакция высвобождения тромбоцитарных факторов Р₃ и Р₄ (табл. 3). Роль этих двух факторов в поддержании гемостатического потенциала велика: фактор Р₃ (тромбоцитарный тромбопластин) – постоянно действующий ускоритель образования протромбиназы по внутреннему механизму; фактор Р₄ (антигепарин) ограничивает антикоагулянтную активность гепарина.

Таблица 2

Влияние ЦП на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (M ± m)

Примечания: n – количество наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.

Таблица 3

Влияние ЦП на реакцию Р₄ высвобождения факторов Р₃ и Р₄ (M ± m)

Примечания: n – количество наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.

Действие ЦП относительно функции тромбоцитов реализуется через его антиоксидантные свойства. В исследованиях in vitro на человеческих тромбоцитах было показано, что инкубация тромбоцитов с ЦП приводит к снижению интенсивности процессов свободнорадикального окисления, общих и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, малонового диальдегида и увеличению активности супероксиддисмутазы в тромбоцитах, что сопровождается снижением их максимальной амплитуды и скорости агрегации [2]. Наличие подобного эффекта подтверждается и в условиях in vivo.

Бедная тромбоцитами плазма (БТП) обладает слабой хемилюминесценцией: максимальная светимость – 0,47 ± 0,04 у.е.; светосумма свечения – 0,75 ± 0,12 у.е. Хемилюминесценция обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) составляет: максимальная светимость – 3,23 ± 0,35 у.е. (р = 0,0076); светосумма свечения – 12,98 ± 1,6 у.е. (р = 0,0084). Добавление АДФ к тромбоцитам значительно увеличивает ХЛ тромбоцитов, а ЦП на 24 час после введения приводит к снижению АДФ-индуцированной хемилюминесценции тромбоцитов крыс (табл. 4).

Таблица 4

Влияние ЦП на АДФ-индуцированную хемилюминесценцию тромбоцитов на 24 час после введения (M ± m)

Примечания: n – число наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.

В работах ряда авторов было показано, что и иные белки острой фазы могут изменять функциональное состояние тромбоцитов, такие как гаптоглобин, трансферрин, a1-кислый гликопротеид и другие. Исследование влияния этих белков на функциональное состояние тромбоцитов выявило снижение агрегационной активности кровяных пластинок [13]. В экспериментах in vitro было показано, что a-глобулин уменьшает коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов. При исследовании трех других плазменных белков: фибриногена, фактора Хагемана и g-глобина снизилась АДФ-индуцированная агрегация. С-реактивный белок также оказал ингибирующее влияние на агрегацию тромбоцитов [15]. Трансферрин не влиет на агрегацию тромбоцитов, это связано, по-видимому, с индивидуальными особенностями белка, в отличие от a1-кислого гликопротеида, который в условиях in vitro снизил эпинефрин- и АДФ-индуцированную агрегацию кровяных пластинок, но при этом изменял только первую волну агрегации, не влияя на вторую [13].

Указывается, что антитромбоцитарные лекарственные препараты одновременно снижают провоспалительную функцию тромбоцитов. Наибольшее количество публикаций касается противовоспалительных эффектов клопидогрела. О способности клопидогрела благоприятно влиять на свидетели процесса воспаления впервые сообщили Chew D.P. и соавт. в 2001 году [6]. Механизм действия антиагрегантного действия клопидогрела связан с ингибированием АДФ-индуцированной активации тромбоцитов за счет блокады пуриновых рецепторов Р2Y12 [5].

Таким образом, белок острой фазы церулоплазмин обладает способностью снижать проагрегантные свойства тромбоцитов, что может расцениваться как наличие обратной связи в реализации процесса воспаления.

Рецензенты:

Головлева Е.С., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии, ГБОУ ВПО ЮУГМУ Министерства здравоохранения РФ, г. Челябинск;

Казачков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии, ГБОУ ВПО ЮУГМУ Министерства здравоохранения РФ, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 10.06.2014.

Библиографическая ссылка