На сегодняшний день тромбоциты рассматриваются как источники гуморальных факторов, стимулирующих одновременно процессы гемостаза и воспаления [14]. Наличие в тромбоцитах м-РНК для синтеза – предшественника ИЛ-1β, каспаз, остеонектина, виментина, убихитина, тканевого ингибитора матриксной металло-протеиназы I типа свидетельствуют о многогранной роли тромбоцитов в процессе воспаления [4]. В α-гранулах тромбоцитов содержатся модуляторы воспаления, такие как Р-селектин, тромбоспондин-1, 4-й фактор тромбоцитов, трансформирующий фактор роста β и RANTES (регуляторы активации процессов экспрессии и секреции нормальных Т-лимфоцитов).
Транскрипторный аппарат тромбоцитов состоит в основном из м-РНК, кодирующей воспалительные белки [5]. Активация тромбоцитов приводит к экспрессии на их поверхности Р-селектина и увеличению интенсивности тромбоцитарно-лейкоцитарной адгезии на эндотелий и циркулирующих тромбоцитарно-моноцитарных агрегатов [9]. Следствием взаимодействия макрофагов с аутологичными тромбоцитами является повышение их провоспалительных свойств [10]. Центральная роль в обеспечении межклеточных взаимодействий принадлежит сигнальной системе – рецептор CD40 и его лиганд – CD40L [9]. Более 90 % CD40L имеют тромбоцитарное происхождение [9]. Наличие на тромбоцитах лиганда CD40 (CD40L) к CD40 позволяет тромбоцитам присоединяться к макрофагам, Т-лимфоцитам и эндотелиальным клеткам. После отсоединения CD40L от поверхности тромбоцита он активирует каскад воспалительных реакций, в который вовлечены такие белки, как Е-селектин, VCAM и ICAM.
Тромбоциты способны экспрессировать внутренние факторы, запускающие как классический, так и альтернативный путь активации комплемента. Подобная активация клеток ‒ следствие действия биохимических агонистов и (или) напряжения сдвига и связана с экспрессией P-селектина, gC1qR и хондроитина сульфата. Тромбоцит как посредник активации комплемента в известной мере увеличивает растворимые воспалительные медиаторы (C3a и C5a) [8].
Другими участниками одновременно тромботического и воспалительного процессов являются высвобождаемые активированными тромбоцитами микрочастицы (PDMP). PDMP принимают участие в адгезии тромбоцитов к поврежденному эндотелию, путем экспрессии Р-селектина, PDMP способствуют агрегации лейкоцитов.
Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что белки острой фазы воспаления прямо или опосредованно могут влиять на тромбоциты, изменяя их функциональное состояние.
Цель исследования – определить наличие и механизмы влияния белка острой фазы – церулоплазмина ‒ на функциональное состояние тромбоцитов.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на 50 половозрелых белых беспородных крысах-самцах массой 180–200 г. Все исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977. Забор крови осуществлялся внутрисердечно, согласно правилам гемостазиологических исследований [1]. Церулоплазмин (ЦП) вводили однократно, внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг веса животного, что составляет 50 % от его физиологического уровня в сыворотке крови крыс. В экспериментах использовался препарат «Церулоплазмин» (НПО «Иммунопрепарат», Уфа). Сроки исследования – 12 часов, 3 и 8 сутки. Ретенцию тромбоцитов оценивали по их способности прилипать к стеклянной поверхности. Способность тромбоцитов к агрегации определяли по методу Борна. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ в конечной концентрации 7∙10–7 М. Агрегационная способность тромбоцитов оценивалась по: лаг-периоду; времени, скорости, максимальной амплитуде. Фактор Р3 определяли по разнице показателей АВР плазмы до и после удаления тромбоцитов из нее по Rabiner, Groder. Фактор Р4 плазмы определяли по действию прогретой БТП на тромбин-гепариновое время свертывания субстратной плазмы [1].
Способность тромбоцитов к продукции свободных радикалов оценивали методом хемилюминесценции [3]. Интенсивность свободнорадикального окисления в тромбоцитах исследовали методом хемилюминесценции с использованием хемилюминометра ХЛ-003. Объем пробы составлял 5 мл обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) с концентрацией клеток 300000 в мкл, использовали медленное перемешивание, температурный режим – 37 °С, время регистрации 30 минут. Интенсивность хемилюминесценции тромбоцитов исследовали в присутствии люминола, так как это соединение, вступающее в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ анализа данных Statistica 6.0, использован непараметрический критерий Манна ‒ Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
Однократное введение ЦП крысам в дозе 50 % от физиологического уровня, что соответствует его повышению при остром воспалении, приводило к снижению ретенционной способности тромбоцитов на весьма длительное время (табл. 1).
Таблица 1
Влияние церулоплазмина на ретенцию тромбоцитов (M ± m)
Показатели Сроки исследования (количество животных) |
Процент ретенции тромбоцитов |
Р |
Контроль (n = 14) |
26,68 ± 0,91 |
– |
12 часов (n = 10) |
21,15 ± 2,01 |
р = 0,0346 |
3 сутки (n = 12) |
24,99 ± 0,56 |
р = 0,0567 |
8 сутки (n = 10) |
21,84 ± 0,67 |
р = 0,0072 |
Примечания: n – число наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.
Под влиянием ЦП изменялась агрегационная способность тромбоцитов, это касалось снижения максимальной амплитуды и скорости агрегации с 12 часов до 8 суток после однократного введения. Удлинение лаг-периода отмечено лишь на 12 час (табл. 2).
Снижалась реакция высвобождения тромбоцитарных факторов Р3 и Р4 (табл. 3). Роль этих двух факторов в поддержании гемостатического потенциала велика: фактор Р3 (тромбоцитарный тромбопластин) – постоянно действующий ускоритель образования протромбиназы по внутреннему механизму; фактор Р4 (антигепарин) ограничивает антикоагулянтную активность гепарина.
Таблица 2
Влияние ЦП на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (M ± m)
Показатели Сроки исследования |
Лаг-период, мин |
Время агрегации, мин |
Максимальная амплитуда агрегации, мм |
Скорость агрегации, мм/мин |
Контроль n = 8 |
0,85 ± 0,04 |
15,74 ± 0,20 |
39,75 ± 0,96 |
2,50 ± 0,05 |
12 часов n = 8 |
1,14 ± 0,08 р = 0,038 |
15,37 ± 0,20 р = 0,367 |
24,70 ± 2,25 р = 0,0007 |
1,60 ± 0,15 р = 0,0067 |
3 сутки n = 7 |
1,18 ± 0,13 р = 0,067 |
15,86 ± 0,14 р = 0,584 |
30,40 ± 1,46 р = 0,0074 |
1,92 ± 0,10 р = 0,0083 |
8 сутки n = 8 |
0,87 ± 0,09 р = 0,854 |
15,75 ± 0,11 р = 0,498 |
23,0 ± 0,67 р = 0,0005 |
1,46 ± 0,04 р = 0,0003 |
Примечания: n – количество наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.
Таблица 3
Влияние ЦП на реакцию Р4 высвобождения факторов Р3 и Р4 (M ± m)
Показатели Сроки исследования (количество животных) |
Р4, с |
Р3, с |
Контроль n = 8 |
68,85 ± 1,70 |
2,63 ± 0,17 |
12 часов n = 7 |
40,86 ± 0,75 р = 0,0004 |
1,71 ± 0,17 р = 0,0046 |
3 сутки n = 7 |
57,07 ± 0,75 р = 0,038 |
1,86 ± 0,24 р = 0,156 |
8 сутки n = 7 |
60,38 ± 3,26 р = 0,343 |
1,67 ± 0,30 р = 0,024 |
Примечания: n – количество наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.
Действие ЦП относительно функции тромбоцитов реализуется через его антиоксидантные свойства. В исследованиях in vitro на человеческих тромбоцитах было показано, что инкубация тромбоцитов с ЦП приводит к снижению интенсивности процессов свободнорадикального окисления, общих и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, малонового диальдегида и увеличению активности супероксиддисмутазы в тромбоцитах, что сопровождается снижением их максимальной амплитуды и скорости агрегации [2]. Наличие подобного эффекта подтверждается и в условиях in vivo.
Бедная тромбоцитами плазма (БТП) обладает слабой хемилюминесценцией: максимальная светимость – 0,47 ± 0,04 у.е.; светосумма свечения – 0,75 ± 0,12 у.е. Хемилюминесценция обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) составляет: максимальная светимость – 3,23 ± 0,35 у.е. (р = 0,0076); светосумма свечения – 12,98 ± 1,6 у.е. (р = 0,0084). Добавление АДФ к тромбоцитам значительно увеличивает ХЛ тромбоцитов, а ЦП на 24 час после введения приводит к снижению АДФ-индуцированной хемилюминесценции тромбоцитов крыс (табл. 4).
Таблица 4
Влияние ЦП на АДФ-индуцированную хемилюминесценцию тромбоцитов на 24 час после введения (M ± m)
Показатели/эксперимент |
Группа контроля (введение физ. раствора) (n = 9) |
Опытная группа (введение ЦП) (n = 9) |
Светосумма, у.е |
40,64 ± 5,33 |
21,55 ± 2,80; р = 0,0065 |
Макс. светимость, у.е |
9,40 ± 1,17 |
5,45 ± 0,63; р = 0,0078 |
Примечания: n – число наблюдений; р – показатель различия с контрольной группой по критерию Манна – Уитни.
В работах ряда авторов было показано, что и иные белки острой фазы могут изменять функциональное состояние тромбоцитов, такие как гаптоглобин, трансферрин, a1-кислый гликопротеид и другие. Исследование влияния этих белков на функциональное состояние тромбоцитов выявило снижение агрегационной активности кровяных пластинок [13]. В экспериментах in vitro было показано, что a-глобулин уменьшает коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов. При исследовании трех других плазменных белков: фибриногена, фактора Хагемана и g-глобина снизилась АДФ-индуцированная агрегация. С-реактивный белок также оказал ингибирующее влияние на агрегацию тромбоцитов [15]. Трансферрин не влиет на агрегацию тромбоцитов, это связано, по-видимому, с индивидуальными особенностями белка, в отличие от a1-кислого гликопротеида, который в условиях in vitro снизил эпинефрин- и АДФ-индуцированную агрегацию кровяных пластинок, но при этом изменял только первую волну агрегации, не влияя на вторую [13].
Указывается, что антитромбоцитарные лекарственные препараты одновременно снижают провоспалительную функцию тромбоцитов. Наибольшее количество публикаций касается противовоспалительных эффектов клопидогрела. О способности клопидогрела благоприятно влиять на свидетели процесса воспаления впервые сообщили Chew D.P. и соавт. в 2001 году [6]. Механизм действия антиагрегантного действия клопидогрела связан с ингибированием АДФ-индуцированной активации тромбоцитов за счет блокады пуриновых рецепторов Р2Y12 [5].
Таким образом, белок острой фазы церулоплазмин обладает способностью снижать проагрегантные свойства тромбоцитов, что может расцениваться как наличие обратной связи в реализации процесса воспаления.
Рецензенты:
Головлева Е.С., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии, ГБОУ ВПО ЮУГМУ Министерства здравоохранения РФ, г. Челябинск;
Казачков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии, ГБОУ ВПО ЮУГМУ Министерства здравоохранения РФ, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 10.06.2014.
Библиографическая ссылка
Ермолаева Е.Н., Кривохижина Л.В., Кантюков С.А., Яковлева В.П. ЦЕРУЛОПЛАЗМИН – ЭНДОГЕННЫЙ РЕГУЛЯТОР ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ТРОМБОЦИТОВ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 7-3. – С. 492-495;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=34469 (дата обращения: 17.08.2024).