Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ СУСТАВНОГО ХРЯЩА В УСЛОВИЯХ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

Новочадов В.В. 1 Гайфуллин Н.М. 2 Фролов Д.М. 1
1 ФГАОУ ВПО «Волгоградский государственный университет», Волгоград
2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва
В эксперименте с использованием 38 белых крыс изучено ремоделирование суставного хряща в норме и при хронической эндогенной интоксикации длительностью 30, 60 и 90 суток. Оценивали морфологию хряща с использованием шкалы H. Mankin в модификации V.B. Kraus, подсчитывали численную плотность хондроцитов, объемные доли хряща, подлежащей костной пластинки и губчатой кости, а также их поверхностные плотности. Определяли проценты клеток, иммунопозитивных к PCNA, TRAIL и каспазе-3. В результате показано, что хроническая эндогенная интоксикация приводит к нарушениям естественной регенерации и ремоделирования хряща. Это проявляется в одновременном ускорении пролиферации и TRAIL-зависимого апоптоза клеток хондрального ряда, а также снижении содержания протеогликанов в хрящевом матриксе, в результате чего в течение 90 суток в эксперименте в коленных суставах крыс формируется умеренно выраженный остеоартроз.
эндогенные интоксикации
липополисахарид
суставной хрящ
хондроциты
остеоартроз
морфология
1. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. – СПб.: СпецЛит, 2010. – 95 c.
2 Индивидуальные различия органов-мишеней и иммунной системы при экспериментальном эндотоксикозе / О.В. Макарова, А.М. Яблонская, Л.П. Михайлова, Н.В. Яглова, Д.И. Солдатов // Архив патологии. – 2009. – № 4. – С. 37–42.
3. Маланин Д.А., Писарев В.Б., Новочадов В.В. Восстановление повреждений хряща в коленном суставе. – Волгоград: Волгогр. н. Изд-во, 2010. – 518 с.
4. Новиков Д.А., Новочадов В.В. Статистические методы в экспериментальной биологии и медицине. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2005. – 84 с
5. Писарев В.Б., Богомолова Н.В., Новочадов В.В. Бактериальный эндотоксикоз: взгляд патолога. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2008. – 320 с
6. Полякова Л.В., Калашникова С.А., Щеголев А.И. Морфологическая характеристика эндокринных органов при хронической эндогенной интоксикации // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – Т. 151, №2. – С. 211–214.
7. Яковлев М.Ю. Элементы эндотоксиновой теории физиологии и патологии человека // Физиология человека. – 2003. – Т. 29. – № 4. – С. 98–109.
8. Beloborodova N.V., Osipov G.A. Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship // Microb. Ecol. Health Disease. – 2000. – Vol. 12, № 1. – P. 12–21.
9. Blagojevic M., Jinks C., Jeffery A., Jordan K.P. Risk factors for onset of osteoarthritis of the knee in older adults: a systematic review and meta-analysis // Osteoarthritis Cartil. – 2010. – Vol. 18. – P. 24–33.
10. Goldring M. B. Chondrogenesis, chondrocyte differentiation, and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis // Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. – 2012. – Vol. 4, № 4. – P. 269–285.
11. Kraus V. B., Huebner J. L., DeGroot J., Bendele A.A. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig // Osteoarthritis Cartil. – 2010. – Vol. 18, Suppl. 3. – Р. 35–52.
12. Patra D., Sandell L. J. Recent advances in biomarkers in osteoarthritis // Curr. Opin. Rheumatol. – 2011. – Vol. 23. – P. 465–470.
13. Pritzker K.P., Gay S., Jimenez S.A., Ostergaard K., Pelletier J.P., Revell P.A. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging // Osteoarthritis Cartil. – 2006. – Vol. 14. – P. 13–29.
14. Wei S.D., Li J.Z., Liu Z.J. et al. Dexamethasone attenuates lipopolysaccharide-induced liver injury by downregulating glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand in Kupffer cells // Hepatol. Res. – 2011. – Vol. 41. – №.10. –
P. 989–999.

Уникальной особенностью суставного хряща, как всех опорных тканей, является то, что его основные функциональные свойства во многом определяются наличием высокоспецифичного внеклеточного матрикса. Постоянное ремоделирование матрикса происходит за счет деятельности хондроцитов и хондробластов, регуляция функций которых непосредственно осуществляется сложным комплексом эндокринных и медиа­торных механизмов, поскольку суставной хрящ не содержит сосудов и нервных окончаний [3, 10].

Множество процессов в организме сопровождаются образованием и накоплением эндогенных токсических соединений, негативные последствия избытка которых описываются как эндогенная интоксикация, а при наличии морфологических проявлений со стороны органов-мишеней (печени, легких, почек) – как эндотоксикоз [2, 5], хотя подтверждается и необходимость участия ряда подобных веществ в физиологических процессах [7, 8]. В развитии хронической эндогенной интоксикации (ХЭИ), помимо прямого действия токсинов, гораздо большее участие принимают компоненты вегетативной, эндокринной дизрегуляции и цитокины системного воспалительного ответа [3, 7, 14].

В связи с этим, естественно предположить, что длительно существующая ХЭИ способна напрямую или через описанные системные механизмы влиять на ремоделирование хрящевой ткани, покрывающей суставные поверхности. Практически с аналогичными процессами связывают возникновение и прогрессирование хронической дегенеративной патологии хряща, традиционно описываемой в отечественной литературе как дисметаболическое заболевание – «остеоартроз», а за рубежом – как воспалительное, osteoarthritis
[3, 9, 12]. Детальная проверка этой гипотезы на настоящем этапе знаний возможна только в эксперименте.

Цель работы – установить закономерности физиологической регенерации и ремоделирования суставного хряща в условиях хронической эндогенной интоксикации, как одного из возможных факторов в развитии его дегенеративной патологии.

Материал и методы исследования

Работа была выполнена с использованием 38 белых крыс-самцов массой от 180 до 240 г., полученных из нелинейных стоков Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Протокол экспериментов соответствовал этическим нормам, изложенным в «Международном кодексе медицинской этики» (1994), Правилах лабораторной практики (GLP), Хельсинской декларации (2000) и Директивах Европейского сообщества 86/609EEC. Закономерности ремоделирования хрящевой ткани были изучены у 16 крыс в условиях ХЭИ, а также у 8 животных, содержавшихся в обычных условиях вивария (контрольная группа). Моделирование ХЭИ проводили по оригинальной методике [5], основанной на раздельном введении малых доз тетрахлорметана и бактериального липополисахарида. В качестве интегральных показателей развития ЭТ использовали определение в сыворотке крови концентрации олигопептидов (ОП, г/л) и продуктов свободно-радикального (перекисного) окисления липидов по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ППОЛ, мкмоль/л). Животных выводили из опыта по 5–6 особей через 30, 60 и 90 суток от начала ХЭИ передозировкой нембутала (100 мг/кг массы).

Перед изготовлением микропрепаратов проводили фиксирование костно-хрящевых фрагментов в течение 48 ч в 10 %-м растворе нейтрального формалина. Затем проводили декальцинацию блоков в 4 %-м растворе ЭДТА (трилона Б) в течение 10 суток и дофиксировали вновь в 10 %-м растворе нейтрального формалина. После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин. С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5–7 мкм, которые монтировали на предметные стекла с адгезивным покрытием. Окрашивали препараты гематоксилином и эозином по общепринятой методике, для выявления матрикса хрящевой ткани использовали окраску толуидиновым синим [1, 13].

Иммуногистохимическое исследование включало в себя определение тканевой экспрессии трех маркеров. Для выявления пролиферативной активности использовали поликлональные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA, DakoCytomation, Дания). Процент иммунопозитивных клеток обозначали как пролиферативный индекс. Для выявления маркеров апоптоза использовали моноклональные антитела к TRAIL (апоптоз-индуцирующий лиганд фактора некроза опухоли) и к каспазе-3 (ключевой фермент необратимого каскада апоптоза) производства Novocastra, Великобритания. Результат обозначали, соответственно, как проапоптотический и апоптотический индексы. Все этапы исследования проводили в соответствии с протоколами производителей, используя вариант температурной демаскировки антигенов, использовали позитивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли антител.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа, для этого использовали аппаратно-компьютерный комплекс «Видеотест-Морфо» 3.0 (Россия). Использовали шкалу полуколичественной оценки H. Mankin в модификации V.B. Kraus et al. [11], учитывающей структуру поверхности хряща (0–8 баллов), содержание протеогликанов в окраске толуилдиновым синим (0–6), плотность расположения хондроцитов и кластеризацию (0–3), целостность остеохондральной линии (0–1) и наличие остеофитов (0–9 баллов). Оценки по критериям выставляли два исследователя по четыре микропрепарата одного и того же случая каждый. Подсчитывали численную плотность хондроцитов в глубоких зонах хряща (1/мм3), объемные доли хряща, подлежащей костной пластинки и губчатой кости на стандартном сечении глубиной в 10 мм (ОД, мм3/мм3), а также их поверхностные плотности (1/мм) [13].

Обработку количественных данных проводили непосредственно из общей матрицы данных Excel 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA) с учетом общепринятых требований для медико-биологических исследований. Для анализа различий между выборками использовали критерий Манна-Уитни. Проводили анализ корреляционной зависимости между отдельными морфометрическими и иммуногистохимическими показателями [4].

Результаты исследования и их обсуждение

На всех сроках опыта в сыворотке крови животных с ХЭИ определялись высокие концентрации ОП. Они составляли 260,3 ± 31,5 мг/л на 30-е сутки, 289,4 ± 33,5 мг/л – на 60-е сутки и 310,5 ± 37,4 мг/л – на 90-е сутки, в сравнении со 115,5 ± 16,8 мг/л у животных контрольной группы (все P < 0,01). Параллельно увеличивалось содержание ППОЛ в сыворотке крови: до 9,33 ± 0,70 ммоль/л на 30-е сутки, до 10,12 ± 0,93 ммоль/л – на 60-е сутки, до 12,07 ± 1,03 ммоль/л – на 90-е сутки, в сравнении с 5,33 ± 0,43 ммоль/л у животных контрольной группы (все P < 0,01). Содержание маркеров ХЭИ было повышено, таким образом, в 1,7–2,7 раза (рис. 1).

Данные количественного гистоморфологического анализа приведены в табл. 1, количественные данные о выявлении маркеров пролиферации и апоптоза – в табл. 2.

Развитие ХЭИ сопровождалось, начиная с 30-х суток эксперимента, появлением небольших неровностей поверхности хряща, к 90-м суткам – явлениями поверхностного растрескивания и разволокнения.

В глубоких зонах хряща выявлялась гиперцеллюлярность, но без явной кластеризации хондроцитов, изменения остеохондральной линии были минимальными, единичные остеофиты выявлялись только к 90-м суткам опыта. В окраске толуидиновым синим показано снижение содержания протеогликанов матрикса до половины поверхностной зоны хряща к 30-м суткам ХЭИ, до половины всей толщины хряща – к 90-м суткам. Все это позволяло отнести обнаруженные изменения к умеренным проявлениям остеоартроза, что подтверждалось результатами оценки по полуколичественной шкале. В контрольной группе в единичных случаях могла быть выставлена оценка в 1–2 балла, но на 30-е сутки оценка возрастала почти до 5 баллов, а к 90-м суткам – свыше 10.

pic_22.tif

Рис. 1. Относительное увеличение содержания интегральных маркеров ХЭИ в сыворотке крови крыс опытной группы (100 % – показатели животных контрольной группы)

Таблица 1

Основные морфометрические показатели суставного хряща в норме и при хронической эндогенной интоксикации (M ± m)

Группа

Сроки эксперимента

Контроль

30 суток

60 суток

90 суток

Оценка по шкале V.B. Kraus, баллов

0,2 ± 0,1

4,8 ± 0,6*

7,9 ± 0,8*

10,7 ± 0,9

Численная плотность хондроцитов в глубоких зонах хряща, 1/мм3

54,3 ± 3,6

68,3 ± 4,2*

75,2 ± 4,0*

61,9 ± 3,7*

Объемная доля хрящевой ткани, мм3/мм3

0,31 ± 0,02

0,34 ± 0,03

0,29 ± 0,03

0,22 ± 0,02*

Объемная доля подлежащей костной пластинки, мм3/мм3

0,18 ± 0,01

0,19 ± 0,02

0,17 ± 0,03

0,27 ± 0,03*

Объемная доля губчатой кости, мм3/мм3

0,45 ± 0,03

0,47 ± 0,05

0,54 ± 0,07

0,51 ± 0,05

Поверхностная плотность хряща, 1/мм

1,15 ± 0,08

1,22 ± 0,10

1,47 ± 0,12*

1,53 ± 0,14*

Поверхностная плотность костной пластинки, 1/мм

1,73 ± 0,13

1,80 ± 0,14

2,64 ± 0,21*

2,93 ± 0,23*

Поверхностная плотность губчатой кости, 1/мм

3,12 ± 0,26

3,15 ± 0,30

7,09 ± 0,54*

7,44 ± 0,59*

Таблица 2

Экспрессия маркеров клеточной пролиферации и апоптоза клеток суставного хряща в норме и при хронической эндогенной интоксикации (M ± m)

Группа

Сроки эксперимента

Контроль

30 суток

60 суток

90 суток

Пролиферативный индекс (по PCNA)

2,24 ± 0,18

4,33 ± 0,34 *

6,45 ± 0,45 *

5,71 ± 0,36 *

Проапоптотический индекс (по TRAIL)

1,55 ± 0,11

6,60 ± 0,54 *

7,05 ± 0,51 *

5,92 ± 0,42 *

Апоптотический индекс (по каспазе-3)

0,21 ± 0,03

2,51 ± 0,19 *

2,48 ± 0,22 *

3,69 ± 0,32 *

Численная плотность хондробластов и хондроцитов в глубоких слоях хряща возрастала к 30-м суткам в 1,25 раза (P < 0,05), к 60-м суткам – в 1,38 раза (P < 0,05), в дальнейшем несколько уменьшаясь. ОД хряща уменьшалась за время эксперимента в 1,41 раза (P < 0,05) при параллельном увеличении ОД костной пластинки в 1,50 раза (P < 0,01), так что ОД губчатой кости существенно не изменялась. За счет явлений разволокнения, а также ремоделирования глубоких слоев хряща и субхондральной кости поверхностные плотности всех изучаемых границ достоверно возрастали: в 1,33 раза для хряща, в 1,69 раза – для подлежащей кости, в 2,38 раза – для губчатой кости.

При определении пролиферативной активности PCNA-позитивные хондробласты у крыс контрольной группы составляли в суставном хряще чуть более 2 % от всех клеток. При ХЭИ их количество возрастало к 30-м суткам в 1,9 раза, к 60-м суткам – в 2,9 раза и оставалось почти на этом уровне к 90-м суткам эксперимента. TRAIL-позитивных клеток в суставном хряще крыс контрольной группы было около 1,5 %, при ХЭИ величина этого показателя возрастала более чем в 4 раза с максимумом на 60-е сутки (более 7 %). Клеток, позитивных к каспазе-3, было при ХЭИ меньше (порядка 2,5–3,7 %), но эти значения более чем в 10 раз превышали аналогичные в суставном хряще крыс контрольной группы. Соотношение апоптоза и пролиферации в суставном хряще при ХЭИ, таким образом, явно смещалось в сторону запрограммированной гибели хондроцитов (рис. 2).

pic_23.tif

Рис. 2. Отношения апоптотического и пролиферативного процессов
в суставном хряще крыс опытной группы

Выявленные изменения свидетельствуют о том, что при ХЭИ суставной хрящ, как и многие уже изученные высокоспециализированные тканевые системы, становится мишенью эндогенных токсических соединений и вызываемых ими медиаторных, нейро-эндокринных и метаболических сдвигов в организме. Происходящие изменения можно описать с позиций дегенеративной патологии хряща, то есть как проявления остеоартроза. Ускорение пролиферации и обновления матрикса при этом явно не восполняет прогрессирующую убыль клеточных элементов и протеогликанов в суставном хряще. Большое количество TRAIL-позитивых хондроцитов на поздних сроках опыта свидетельствует о возрастании потенциальной их уязвимости к любым иным воздействиям, сопровождающимся активацией провоспалительного цитокинового каскада, и является залогом прогрессирования патологического процесса.

Заключение

При хронической эндогенной интоксикации ткань суставного хряща становится мишенью эндогенных токсических соединений и опосредованных ими системных воздействий (прежде всего – медиаторов цитокинового каскада), что приводит к нарушениям естественной регенерации и ремоделирования ткани. Это проявляется в одновременном ускорении пролиферации и TRAIL-зависимого апоптоза клеток хряща, а также снижении содержания протеогликанов в хрящевом матриксе, в результате чего в течение 90 суток в эксперименте в коленных суставах крыс формируется умеренно выраженный остеоартроз.


Библиографическая ссылка

Новочадов В.В., Гайфуллин Н.М., Фролов Д.М. РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ СУСТАВНОГО ХРЯЩА В УСЛОВИЯХ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 10-2. – С. 271-275;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30629 (дата обращения: 31.10.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074