Уникальной особенностью суставного хряща, как всех опорных тканей, является то, что его основные функциональные свойства во многом определяются наличием высокоспецифичного внеклеточного матрикса. Постоянное ремоделирование матрикса происходит за счет деятельности хондроцитов и хондробластов, регуляция функций которых непосредственно осуществляется сложным комплексом эндокринных и медиаторных механизмов, поскольку суставной хрящ не содержит сосудов и нервных окончаний [3, 10].
Множество процессов в организме сопровождаются образованием и накоплением эндогенных токсических соединений, негативные последствия избытка которых описываются как эндогенная интоксикация, а при наличии морфологических проявлений со стороны органов-мишеней (печени, легких, почек) – как эндотоксикоз [2, 5], хотя подтверждается и необходимость участия ряда подобных веществ в физиологических процессах [7, 8]. В развитии хронической эндогенной интоксикации (ХЭИ), помимо прямого действия токсинов, гораздо большее участие принимают компоненты вегетативной, эндокринной дизрегуляции и цитокины системного воспалительного ответа [3, 7, 14].
В связи с этим, естественно предположить, что длительно существующая ХЭИ способна напрямую или через описанные системные механизмы влиять на ремоделирование хрящевой ткани, покрывающей суставные поверхности. Практически с аналогичными процессами связывают возникновение и прогрессирование хронической дегенеративной патологии хряща, традиционно описываемой в отечественной литературе как дисметаболическое заболевание – «остеоартроз», а за рубежом – как воспалительное, osteoarthritis
[3, 9, 12]. Детальная проверка этой гипотезы на настоящем этапе знаний возможна только в эксперименте.
Цель работы – установить закономерности физиологической регенерации и ремоделирования суставного хряща в условиях хронической эндогенной интоксикации, как одного из возможных факторов в развитии его дегенеративной патологии.
Материал и методы исследования
Работа была выполнена с использованием 38 белых крыс-самцов массой от 180 до 240 г., полученных из нелинейных стоков Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Протокол экспериментов соответствовал этическим нормам, изложенным в «Международном кодексе медицинской этики» (1994), Правилах лабораторной практики (GLP), Хельсинской декларации (2000) и Директивах Европейского сообщества 86/609EEC. Закономерности ремоделирования хрящевой ткани были изучены у 16 крыс в условиях ХЭИ, а также у 8 животных, содержавшихся в обычных условиях вивария (контрольная группа). Моделирование ХЭИ проводили по оригинальной методике [5], основанной на раздельном введении малых доз тетрахлорметана и бактериального липополисахарида. В качестве интегральных показателей развития ЭТ использовали определение в сыворотке крови концентрации олигопептидов (ОП, г/л) и продуктов свободно-радикального (перекисного) окисления липидов по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ППОЛ, мкмоль/л). Животных выводили из опыта по 5–6 особей через 30, 60 и 90 суток от начала ХЭИ передозировкой нембутала (100 мг/кг массы).
Перед изготовлением микропрепаратов проводили фиксирование костно-хрящевых фрагментов в течение 48 ч в 10 %-м растворе нейтрального формалина. Затем проводили декальцинацию блоков в 4 %-м растворе ЭДТА (трилона Б) в течение 10 суток и дофиксировали вновь в 10 %-м растворе нейтрального формалина. После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин. С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5–7 мкм, которые монтировали на предметные стекла с адгезивным покрытием. Окрашивали препараты гематоксилином и эозином по общепринятой методике, для выявления матрикса хрящевой ткани использовали окраску толуидиновым синим [1, 13].
Иммуногистохимическое исследование включало в себя определение тканевой экспрессии трех маркеров. Для выявления пролиферативной активности использовали поликлональные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA, DakoCytomation, Дания). Процент иммунопозитивных клеток обозначали как пролиферативный индекс. Для выявления маркеров апоптоза использовали моноклональные антитела к TRAIL (апоптоз-индуцирующий лиганд фактора некроза опухоли) и к каспазе-3 (ключевой фермент необратимого каскада апоптоза) производства Novocastra, Великобритания. Результат обозначали, соответственно, как проапоптотический и апоптотический индексы. Все этапы исследования проводили в соответствии с протоколами производителей, используя вариант температурной демаскировки антигенов, использовали позитивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли антител.
Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа, для этого использовали аппаратно-компьютерный комплекс «Видеотест-Морфо» 3.0 (Россия). Использовали шкалу полуколичественной оценки H. Mankin в модификации V.B. Kraus et al. [11], учитывающей структуру поверхности хряща (0–8 баллов), содержание протеогликанов в окраске толуилдиновым синим (0–6), плотность расположения хондроцитов и кластеризацию (0–3), целостность остеохондральной линии (0–1) и наличие остеофитов (0–9 баллов). Оценки по критериям выставляли два исследователя по четыре микропрепарата одного и того же случая каждый. Подсчитывали численную плотность хондроцитов в глубоких зонах хряща (1/мм3), объемные доли хряща, подлежащей костной пластинки и губчатой кости на стандартном сечении глубиной в 10 мм (ОД, мм3/мм3), а также их поверхностные плотности (1/мм) [13].
Обработку количественных данных проводили непосредственно из общей матрицы данных Excel 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA) с учетом общепринятых требований для медико-биологических исследований. Для анализа различий между выборками использовали критерий Манна-Уитни. Проводили анализ корреляционной зависимости между отдельными морфометрическими и иммуногистохимическими показателями [4].
Результаты исследования и их обсуждение
На всех сроках опыта в сыворотке крови животных с ХЭИ определялись высокие концентрации ОП. Они составляли 260,3 ± 31,5 мг/л на 30-е сутки, 289,4 ± 33,5 мг/л – на 60-е сутки и 310,5 ± 37,4 мг/л – на 90-е сутки, в сравнении со 115,5 ± 16,8 мг/л у животных контрольной группы (все P < 0,01). Параллельно увеличивалось содержание ППОЛ в сыворотке крови: до 9,33 ± 0,70 ммоль/л на 30-е сутки, до 10,12 ± 0,93 ммоль/л – на 60-е сутки, до 12,07 ± 1,03 ммоль/л – на 90-е сутки, в сравнении с 5,33 ± 0,43 ммоль/л у животных контрольной группы (все P < 0,01). Содержание маркеров ХЭИ было повышено, таким образом, в 1,7–2,7 раза (рис. 1).
Данные количественного гистоморфологического анализа приведены в табл. 1, количественные данные о выявлении маркеров пролиферации и апоптоза – в табл. 2.
Развитие ХЭИ сопровождалось, начиная с 30-х суток эксперимента, появлением небольших неровностей поверхности хряща, к 90-м суткам – явлениями поверхностного растрескивания и разволокнения.
В глубоких зонах хряща выявлялась гиперцеллюлярность, но без явной кластеризации хондроцитов, изменения остеохондральной линии были минимальными, единичные остеофиты выявлялись только к 90-м суткам опыта. В окраске толуидиновым синим показано снижение содержания протеогликанов матрикса до половины поверхностной зоны хряща к 30-м суткам ХЭИ, до половины всей толщины хряща – к 90-м суткам. Все это позволяло отнести обнаруженные изменения к умеренным проявлениям остеоартроза, что подтверждалось результатами оценки по полуколичественной шкале. В контрольной группе в единичных случаях могла быть выставлена оценка в 1–2 балла, но на 30-е сутки оценка возрастала почти до 5 баллов, а к 90-м суткам – свыше 10.
Рис. 1. Относительное увеличение содержания интегральных маркеров ХЭИ в сыворотке крови крыс опытной группы (100 % – показатели животных контрольной группы)
Таблица 1
Основные морфометрические показатели суставного хряща в норме и при хронической эндогенной интоксикации (M ± m)
Группа |
Сроки эксперимента |
|||
Контроль |
30 суток |
60 суток |
90 суток |
|
Оценка по шкале V.B. Kraus, баллов |
0,2 ± 0,1 |
4,8 ± 0,6* |
7,9 ± 0,8* |
10,7 ± 0,9 |
Численная плотность хондроцитов в глубоких зонах хряща, 1/мм3 |
54,3 ± 3,6 |
68,3 ± 4,2* |
75,2 ± 4,0* |
61,9 ± 3,7* |
Объемная доля хрящевой ткани, мм3/мм3 |
0,31 ± 0,02 |
0,34 ± 0,03 |
0,29 ± 0,03 |
0,22 ± 0,02* |
Объемная доля подлежащей костной пластинки, мм3/мм3 |
0,18 ± 0,01 |
0,19 ± 0,02 |
0,17 ± 0,03 |
0,27 ± 0,03* |
Объемная доля губчатой кости, мм3/мм3 |
0,45 ± 0,03 |
0,47 ± 0,05 |
0,54 ± 0,07 |
0,51 ± 0,05 |
Поверхностная плотность хряща, 1/мм |
1,15 ± 0,08 |
1,22 ± 0,10 |
1,47 ± 0,12* |
1,53 ± 0,14* |
Поверхностная плотность костной пластинки, 1/мм |
1,73 ± 0,13 |
1,80 ± 0,14 |
2,64 ± 0,21* |
2,93 ± 0,23* |
Поверхностная плотность губчатой кости, 1/мм |
3,12 ± 0,26 |
3,15 ± 0,30 |
7,09 ± 0,54* |
7,44 ± 0,59* |
Таблица 2
Экспрессия маркеров клеточной пролиферации и апоптоза клеток суставного хряща в норме и при хронической эндогенной интоксикации (M ± m)
Группа |
Сроки эксперимента |
|||
Контроль |
30 суток |
60 суток |
90 суток |
|
Пролиферативный индекс (по PCNA) |
2,24 ± 0,18 |
4,33 ± 0,34 * |
6,45 ± 0,45 * |
5,71 ± 0,36 * |
Проапоптотический индекс (по TRAIL) |
1,55 ± 0,11 |
6,60 ± 0,54 * |
7,05 ± 0,51 * |
5,92 ± 0,42 * |
Апоптотический индекс (по каспазе-3) |
0,21 ± 0,03 |
2,51 ± 0,19 * |
2,48 ± 0,22 * |
3,69 ± 0,32 * |
Численная плотность хондробластов и хондроцитов в глубоких слоях хряща возрастала к 30-м суткам в 1,25 раза (P < 0,05), к 60-м суткам – в 1,38 раза (P < 0,05), в дальнейшем несколько уменьшаясь. ОД хряща уменьшалась за время эксперимента в 1,41 раза (P < 0,05) при параллельном увеличении ОД костной пластинки в 1,50 раза (P < 0,01), так что ОД губчатой кости существенно не изменялась. За счет явлений разволокнения, а также ремоделирования глубоких слоев хряща и субхондральной кости поверхностные плотности всех изучаемых границ достоверно возрастали: в 1,33 раза для хряща, в 1,69 раза – для подлежащей кости, в 2,38 раза – для губчатой кости.
При определении пролиферативной активности PCNA-позитивные хондробласты у крыс контрольной группы составляли в суставном хряще чуть более 2 % от всех клеток. При ХЭИ их количество возрастало к 30-м суткам в 1,9 раза, к 60-м суткам – в 2,9 раза и оставалось почти на этом уровне к 90-м суткам эксперимента. TRAIL-позитивных клеток в суставном хряще крыс контрольной группы было около 1,5 %, при ХЭИ величина этого показателя возрастала более чем в 4 раза с максимумом на 60-е сутки (более 7 %). Клеток, позитивных к каспазе-3, было при ХЭИ меньше (порядка 2,5–3,7 %), но эти значения более чем в 10 раз превышали аналогичные в суставном хряще крыс контрольной группы. Соотношение апоптоза и пролиферации в суставном хряще при ХЭИ, таким образом, явно смещалось в сторону запрограммированной гибели хондроцитов (рис. 2).
Рис. 2. Отношения апоптотического и пролиферативного процессов
в суставном хряще крыс опытной группы
Выявленные изменения свидетельствуют о том, что при ХЭИ суставной хрящ, как и многие уже изученные высокоспециализированные тканевые системы, становится мишенью эндогенных токсических соединений и вызываемых ими медиаторных, нейро-эндокринных и метаболических сдвигов в организме. Происходящие изменения можно описать с позиций дегенеративной патологии хряща, то есть как проявления остеоартроза. Ускорение пролиферации и обновления матрикса при этом явно не восполняет прогрессирующую убыль клеточных элементов и протеогликанов в суставном хряще. Большое количество TRAIL-позитивых хондроцитов на поздних сроках опыта свидетельствует о возрастании потенциальной их уязвимости к любым иным воздействиям, сопровождающимся активацией провоспалительного цитокинового каскада, и является залогом прогрессирования патологического процесса.
Заключение
При хронической эндогенной интоксикации ткань суставного хряща становится мишенью эндогенных токсических соединений и опосредованных ими системных воздействий (прежде всего – медиаторов цитокинового каскада), что приводит к нарушениям естественной регенерации и ремоделирования ткани. Это проявляется в одновременном ускорении пролиферации и TRAIL-зависимого апоптоза клеток хряща, а также снижении содержания протеогликанов в хрящевом матриксе, в результате чего в течение 90 суток в эксперименте в коленных суставах крыс формируется умеренно выраженный остеоартроз.
Библиографическая ссылка
Новочадов В.В., Гайфуллин Н.М., Фролов Д.М. РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ СУСТАВНОГО ХРЯЩА В УСЛОВИЯХ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 10-2. – С. 271-275;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30629 (дата обращения: 17.08.2024).