Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

IMMUNOTOXIC EFFECT OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA EXOTOXIN A ON WHITE RATS

Morrison А.V. 1 Popovich V.I. 1 Morrison V.V. 1
1 Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky
В экспериментах на белых крысах в динамике синегнойной интоксикации (1, 2, 5 суток) изучено иммунотоксическое действие различных доз (0,1–1,0 LD50) экзотоксина А (ЭТ-А) Pseudomonas aeruginosa. Исследованы массы тимуса, селезенки, общее количество лимфоцитов, процентное содержание Т- и В-лимфоцитов в тимусе и селезенке, количество циркулирующих иммунных комплексов в крови. Установлено, что имеется дозозависимый эффект ЭТ-А, заключающийся в изменении массы и клеточного состава лимфоидных органов нелинейных крыс во все сроки наблюдения.
Immunotoxic effect of different doses (0,1–1,0 LD50) of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A has been determined in dynamics of intoxication process. The experiments have been held on white rates for the period of 1, 2 or 5 days. The following parameters have been detected in the study: the thymus mass, the spleen mass, the lymphocyte count, the percentage of T- and B-lymphocytes in thymus and spleen, the quantity of circulating immune complexes in blood. The dose dependant effect of exotoxin A has been found out. It resulted in the changes of mass and cellular composition of lymphoid organs of white rats in any period of the study.
Pseudomonas infection exotoxin A
mass and cellular composition of lymphoid organs
1. Moroz A.F., Antsiferova N.G., Baskakova N.V., Sinegnoinaya infektsia, Moscow, Meditsina, 1988. 256 p.
2. Morrison V.V., Morrison A.V., Kolichestvennye i kachestvennye izmenenija kletochnogo sostava perifericheskoy krovi eksperimentalnykh zhivotnykh pri deystvii sinegnoynogo ekzotoksina // Fundamentalnye issledovanija, 2008, no. 4, pp. 19–25.
3. Rudnov V.A., Belsky D.V., Dekhnich F.V., issledovatelskaya gruppa RIORITa // Klin.mikrobiol antimikrob khimioter, 2011, vol. 13, no. 4, pp. 294–303.
4. Chastre J., Trouillet J.L. Problem pathogens (Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter) // Semin Respir Infect. 2000. Vol. 15. рр. 287–298.
5. Deng Q., Barbieri J.T. Molecular mechanisms of the cytotoxicity of ADP-ribosylating toxins // Annu Rev Microbiol. 2008. Vol. 62. рр. 271–288.
6. Denis-Mize K.S. Analysis of immunization with DNA encoding Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. / Denis-Mize K.S., Price B.M., Baker N.R., et al. // FEMS Immunol Med Microbiol. 2000; 27(2): 147–154.
7. Jger D., Werdan K., Muller-Werdan U. Endogenous ADP-ribosylation of elongation factor-2 by interleukin-1β. // Mol Cell Biochem. 2011. Vol.348. no. 1–2. рр. 125–128.
8. Malterud K., Thesen J. Whirlpool and pseudomonas infection--a local outbreak // Tidsskr. Nor. Laegeforen. 2007. Vol. 127, no. 13. рр. 1779–1781.
9. Manafi A. Active immunization using exotoxin A confers protection against Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn model / Manafi A., Kohanteb J., Mehrabani D. et al. // BMC Microbiol. 2009. Vol. 9. no. 23. availadle at: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 19183501.
10. Miyazaki S. Role of exotoxin A in inducing severe Pseudomonas aeruginosa infections in mice / Miyazaki S., Matsumoto T., Tateda K.. et al. // J Med Microbiol. 1995. Vol. 43, no. 3. рр. 169–175.
11. Nikbin V.S. Molecular identification and detection of virulence genes among Pseudomonas aeruginosa isolated from different infectious origins. /Nikbin V.S., Aslani M.M., Sharafi Z. et al. // Iran J Microbiol. 2012. Vol. 4, no. 3. рр. 118–123.
12. Pearson J.P., Pesci E.C., Iglewski B.H. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of elastase and rhamnolipid biosynthesis genes. //J Bacteriol. 1997. Vol. 179, no. 18. рр. 5756–5767.
13. Vidal D.R., Garrone P., Banchereau J. Immunosupressive effects of Pseudomonas aeruginosa exotoxin-a on human lymphocytes-B // Toxicon. 1993. Vol. 31. рр. 27–34.
14. Yates S.P. Stealth and mimicry by deadly bacterial toxins. / Yates S.P., Jorgensen R., Andersen G.R., Merrill A.R. // Trends Biochem. Sci., 2006. Vol. 31, no. 2. рр. 123–133.
15. Zar H.J., Cotton M.F. Nosocomial pneumonia in pediatric patients: practical problems and rational solutions // Paediatr Drugs. 2002. Vol. 4. no. 2. рр. 73–83.

В структуре инфекционной заболеваемости, связанной c условно-патогенными грамотрицательными бактериями, основное значение придается инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa (синегнойной палочкой), являющейся грамотрицательным оппортунистическим патогеном. Тревожным фактом является распространенность данной инфекции без тенденции к снижению. Нозокомиальные инфекции, обусловленные Pseudomonas aeruginosa, ассоциируются с высоким уровнем смертности, значительно превышающим таковой для инфекций, вызванных другими бактериальными патогенами, сложностями в антимикробной терапии [3, 4, 15].

P. aeruginosa обладает многочисленными факторами вирулентности (пигменты, ферменты, токсины). Анализ данных литературы показал, что в патогенезе синегнойной инфекции ведущим экстраклеточным фактором патогенности является экзотоксин А (ЭТ-А), который продуцируется большинством (до 90 %) клинических штаммов синегнойной палочки [1, 11, 14]. Доказано, что в основе молекулярного механизма действия экзотоксина А лежит ферментативный гидролиз никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и рибозилирование фактора элонгации 2 (ФЭ-2), который принимает участие в удлинении полипептидной цепи на рибосомах клетки. При этом комплекс АДФР-ФЭ-2 становится неактивным и не может участвовать в синтезе белка [5, 7].

ЭТ-А обладает выраженным цитотоксическим действием в различных тканях. Выявлены доза и времязависимый эффект токсина на количественные и качественные показатели периферической крови белых мышей и крыс [2]. Через 30 мин после внутривенного введения мышам токсин уменьшает количество полиморфноядерных лейкоцитов более чем на 50 %, но это снижение может быть предотвращено предварительным введением моноклональных антител к токсину. ЭТ-А также ингибирует фагоцитоз, образование IgM и IgG. Вероятно, вызванная токсином деструкция клеток иммунной системы, развитие иммуносупрессии может способствовать поддержанию синегнойной инфекции [10, 12, 13]. Больные, у которых до заболевания имелись антитела к ЭТ-А, реже умирают от псевдомонадного сепсиса [6]. Активная иммунизация мышей с помощью ослабленного токсина оказывает протективный эффект при синегнойной инфекции [9].

В этой связи представляется важным выяснить влияние ЭТ-А на некоторые показатели естественного иммунитета при экспериментальной синегнойной интоксикации.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на нелинейных белых крысах весом 180–250 г после внутрибрюшинного введения ЭТ-А в дозе 0,1, 0,5 и 1,0 LD50 в динамике развития интоксикации. Для анализа иммунологических, патоморфологических и клинико-биохимических показателей кровь забирали у крыс прижизненно из подъязычной вены через 1, 2 и 5 суток.

Оценку иммунного статуса нелинейных крыс проводили по показателям массы лимфоидных органов (тимуса и селезенки) и количеству лимфоцитов в них, а также по популяционному составу лимфоцитов селезенки, по функциональной активности лимфоцитов, концентрации циркулирующих иммунных комплексов и лизоцима в сыворотке крови.

Для активации Т-лимфоцитов использовали фитогемаглютинин (ФГА), для активации В-лимфоцитов – липополисахарид (ЛПС).

Активность кислороднезависимого механизма фагоцитоза оценивали по уровню катионных белков в нейтрофилах на основании лизосомально-катионного теста (ЛКТ). В качестве показателя гуморальной защищенности определяли активность лизоцима.

Результаты исследования и их обсуждение

Представленные данные свидетельствуют о том, что при воздействии ЭТ-А на организм нелинейных крыс происходят изменения массы и клеточного состава лимфоидных органов подопытных животных. Интоксикация дозой 0,1 LD50 токсина приводит к достоверному снижению массы тимуса на 5 сутки наблюдения, в то время как при поражении дозой 1,0 LD50 уже на первые сутки интоксикации наблюдается значительное снижение массы лимфоидных органов.

Оценивая приведенные экспериментальные данные, можно отметить, что воздействие ЭТ-А в дозе 0,1 LD50 приводит к уменьшению клеточного состава лимфоцитов селезенки в ранние сроки после начала интоксикации. Эти отклонения затрагивают в основном В-клеточное звено иммунной системы.

При воздействии более высокой дозы токсина общее количество клеток в селезенке на первые сутки интоксикации остается в пределах нормы благодаря значительному увеличению количества Т-лимфоцитов, несмотря на то, что количество В-лимфоцитов достоверно снижается. Но уже на вторые сутки после воздействия токсина количество этих клеток резко возрастает. Это, на наш взгляд, связано с активацией В-системы за счет Т-клеточного звена иммунной системы, одна из субпопуляций которого вырабатывает лимфокины, стимулирующие пролиферацию В-клеток. Этот процесс, по нашему мнению, является компенсаторной реакцией иммунной системы на воздействие токсина, направленной на поддержание иммунологического гомеостаза. Проведенные исследования свидетельствует о глубине поражения клеточного звена иммунной системы, что подтверждает ранее полученные данные [12, 13].

Добавление Т- и В-митогенов животным, отравленным ЭТ-А в дозе 0,1 LD50, на ранней стадии интоксикации способствовало возрастанию индекса стимуляции, однако из-за большого разброса данных это увеличение не было статистически значимым.

Как видно из таблицы, при введении больших доз ЭТ-А имеется значительное дозо- и времязависимое падение уровня катионных белков нейтрофилов. Так, на 2-е сутки после воздействия токсина у животных, получивших дозу токсина на уровне 0,5 и 1 LD50, содержание катионных белков в нейтрофилах крайне низкое. Так после введения ЭТ-А в дозе, равной 1LD50, содержание катионных белков уменьшилось в 5 раз. Это свидетельствует о резком нарушении функционально-метаболического статуса клеток этого типа. На это же указывает и тенденция к общему снижению численности лейкоцитов, а также такой признак, как существенное уменьшение относительной доли нейтрофилов в составе лейкоцитарной популяции. Падение ЛКТ принято считать неблагоприятным прогностическим признаком при различного рода тяжелых инфекционных заболеваниях и химических интоксикациях.

При введении различных доз ЭТ-А ни на одной стадии интоксикации не было обнаружено изменение активности лизоцима.

Таким образом, можно сделать вывод, что при воздействии на организм нелинейных крыс малой дозы токсина благодаря активации и работе компенсаторных механизмов иммунной системы к пятым суткам интоксикации практически все исследуемые показатели приближаются к значениям нормы. А при оценке влияния большей дозы токсина (1,0 LD50) полученные данные свидетельствуют о значительной глубине поражения клеточного звена иммунной системы, выходящего за пределы адаптационных возможностей иммунокомпетентных клеток.

Снижение концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови на первые сутки интоксикации токсином в дозе, равной 0,1 LD50, свидетельствует о снижении антителообразования у подопытных животных. Это вполне согласуется со снижением количества В-лимфоцитов, которые ответственны за выработку антител.

Таким образом, установлено выраженное иммунотоксическое действие экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa на организм нелинейных белых крыс во все сроки наблюдения, проявляющееся даже при воздействии сублетальных доз токсина.

Иммунотоксические свойства экзотоксина А Ps. aeruginosa для нелинейных крыс

Иммунологический показатель, ед. измерения

Группа животных

Значение показателя в динамике интоксикации

1 сутки

2 суток

5 суток

Масса тимуса, г

контроль

0,153 ± 0,016

0,153 ± 0,016

0,153 ± 0,016

0,1LD50

0,124 ± 0,02

0,167 ± 0,024

0,094 ± 0,006*

LD50

0,102 ± 0,014*

0,117 ± 0,012

Количество лимфоцитов в тимусе, млн

контроль

30,8 ± 6,9

30,8 ± 6,9

30,8 ± 6,9

0,1LD50

20,2 ± 4,31

11,33 ± 2,48*

15,0 ± 3,03

LD50

16,83 ± 2,79

19,25 ± 6,0

Масса селезенки, г

контроль

1,20 ± 0,12

1,20 ± 0,12

1,20 ± 0,12

0,1LD50

1,06 ± 0,19

0,93 ± 0,08

1,15 ± 0,14

LD50

0,76 ± 0,08*

1,09 ± 0,20

Количество лимфоцитов в селезенке, млн

контроль

87,17 ± 21,45

87,17 ± 21,45

87,17 ± 21,45

0,1LD50

24,8 ± 4,65*

29,5 ± 10,56*

101,83 ± 22,17

LD50

84,33 ± 27,69

23,5 ± 3,57*

Количество B-лимфоцитов в селезенке, %

контроль

31,33 ± 2,92

31,33 ± 2,92

31,33 ± 2,92

0,1LD50

18,17 ± 1,05*

33,83 ± 4,38

26,67 ± 2,87

LD50

20,17 ± 2,46*

48,40 ± 5,73*

Количество T-лимфоцитов в селезенке, %

контроль

21,5 ± 1,88

21,5 ± 1,88

21,5 ± 1,88

0,1LD50

27,0 ± 2,82

24,5 ± 1,34

19,0 ± 1,21

LD50

31,67 ± 3,73*

27,6 ± 3,41

ЦИК, компл/100 мл

контроль

71,9 ± 4,47

71,9 ± 4,47

71,9 ± 4,47

0,1LD50

45,5 ± 9,26*

81,4 ± 12,25

62,17 ± 5,97

LD50

74,2 ± 13,32

59,6 ± 10,45

Лизоцим, мкг/мл

контроль

2,77 ± 0,28

2,77 ± 0,28

2,77 ± 0,28

0,1LD50

3,36 ± 0,30

3,01 ± 0,19

2,17 ± 0,18

LD50

3,94 ± 0,67

3,17 ± 0,24

Индекс стимуляции (ФГА)

контроль

1,01 ± 0,06

1,01 ± 0,06

1,01 ± 0,06

0,1LD50

1,27 ± 0,13

0,99 ± 0,06

1,1 ± 0,14

LD50

1,08 ± 0,05

0,90 ± 0,08

Индекс стимуляции, (ЛПС)

контроль

1,36 ± 0,08

1,36 ± 0,08

1,36 ± 0,08

0,1LD50

1,52 ± 0,15

1,27 ± 0,09

1,72 ± 0,21

LD50

1,24 ± 0,06

1,46 ± 0,09

ЛКТ, ед

контроль

1,70 ± 0,10

1,70 ± 0,15

1,80 ± 0,12

0,1LD50

1,10 ± 0,08*

1,50 ± 0,18

1,50 ± 0,11

0,5LD50

0,50 ± 0,05*

0,80 ± 0,07*

1,10 ± 0,14*

LD50

0,30 ± 0,03*

0,40 ± 0,09*

Примечание. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. * – достоверность отличий показателей от контрольных по t-критерию Стьюдента при р 0,05. Набор показателей на 5 сутки для дозы 1,0 LD50 отсутствует в связи с падежом особей данной группы. Каждая группа включала 10 животных.

Рецензенты:

Чеснокова Н.П., д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского», г. Саратов;

Пучиньян Д.М., д.м.н., заместитель директора по науке Саратовского НИИ травматологии и ортопедии Минздрава РФ, г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 02.03.2015.