Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

ELABORATION OF METTHODS OF IDENTIFICATION AND DETECTION OF PHAGE OF THE BACTERIUM PSEUDOMONAS FLUORESCENS

Vasiliev D.A. 1 Viktorov D.A. 1 Artamonov A.M. 1 Grineva T.A. 1 Lashenko E.A. 1
1 Ulyanovsk State Agricultural Academy named PA Stolypin
В проделанной работе из объектов окружающей среды (пробы прудовой воды, почвы, патологический материал, полученный от рыб с признаками заболевания псевдомонозом, сточные воды) методом накопления было выделено 5 штаммов бактериофагов, активных в отношении бактерий Pseudomonas fluorescens. Изучены их основные биологические свойства: спектр литической активности, специфичность, морфология негативных колоний, литическая активность по Грациа. Полученные данные позволили разработать биопрепарат на основе бактериофага Pf01F1-УГСХА, обладающего специфичностью в отношении Pseudomonas fluorescens, спектром литической активности 86,2 %, литической активностью по Грациа 0,7 (±0,1)∙108 БОЕ/мл. Авторами работы была разработана схема фагоидентификации методом спот-теста, позволяющая проводить исследование после выделения чистой культуры за 12–18 часов, а также схема фагодетекции методом реакции нарастания титра фага (РНФ), позволяющая за 24 часа выявлять наличие Pseudomonas fluorescens в пробах пищевого сырья, продуктов питания, патологического материала рыб и объектов окружающей среды при количестве клеток Pseudomonas fluorescens от 103 к.о.е./мл. Разработанные методы удобны для диагностики псевдомонозов рыб, вызываемых Pseudomonas fluorescens, в лабораториях любого уровня.
In the performed work five strains of bacteriophages which are active in relation to bacterium Pseudomonas fluorescens were isolated from environmental objects of a similar kind as: samples of pond water, pond soil samples, pathological material derived from fish showing signs of disease pseudomonosis. Basic biological properties of these bacteriophages such as: the lytic activity spectrum, the specificity, the morphology of plaques, lytic activity by Grazia were studied. The data obtained allowed us to develop bacteriophage-based biopreparation Pf01F1-УГСХА having specificity in point of Pseudomonas fluorescens, the lytic activity spectrum 86,2 %, lytic activity by Grazia 0,7(±0,1)∙108 PFU/ml. The authors developed the scheme of phage identification by spot-test conducting research after isolation of a pure culture for 12–18 hours, and also the scheme of phage detection by phage’s titer rise reaction wich doesn’t require prior isolation of a pure culture and allow to detect the presence of Pseudomonas fluorescens in 24 hours in samples of food raw materials, in the food, in fishs’ pathological material and other environmental objects when the number of cells is more than 103 CFU/ml. The developed methods are useful for diagnosis of fish’s pseudomonosis caused by Pseudomonas fluorescens, in the laboratories of any level.
Pseudomonas fluorescens
bacteriophage
phage identification
phage detection
reaction of the rise of phage’s content
fishs’ pseudomonosis
1. Vasil’ev D.A. Vydelenie bakteriofagov bakterij Pseudomonas putida i ih selekcija v celjah sozdanija biopreparata dlja diagnostiki psevdomonoza ryb / D.A. Vasil’ev, D.A. Viktorov, I.I. Bogdanov // Estestvennye i tehnicheskie nauki. 2011. no. 2(52). pp. 79–82.
2. Vasil’eva Ju.B. Razrabotka metodov fagodiagnostiki bordetelljoza / Ju.B. Vasil’eva // Vestnik ul’janovskoj gosudarstvennoj sel’skohozjajstvennoj akademii. Ul’janovsk: Ul’janovskaja gosudarstvennaja sel’skohozjajstvennaja akademija im. P.A. Stolypina, 2013. no. 2. pp. 51–55.
3. Viktorov D.A. Vydelenie i izuchenie biologicheskih svojstv bakteriofagov Pseudomonas fluorescens / D.A. Viktorov, A.M. Artamonov, D.A. Vasil’ev // Veterinarija i kormlenie. Moskva: «VETKORM», 2012. no. 5. pp. 8–9.
4. Vjalova G.P. Metody bor’by i profilaktiki psevdomonoza molodi gorbushi / G.P. Vjalova, A.V. Polteva, Z.K. Shkurina // Inform. listok SahCNTI. 1995. no. 38–95. pp. 4.
5. Zolotuhin S.N. Sozdanie i razrabotka shem primenenija diagnosticheskih biopreparatov na osnove vydelennyh i izuchennyh bakteriofagov jenterobakterij / S.N. Zolotuhin // Avtoref. dis. ... d-ra biol. nauk. Ul’janovsk, 2007. 39 p.
6. Zueva L.P. Bakteriofagi faktory jevoljucii gospital’nyh shtammov i sredstva bor’by s infekcijami / L.P. Zueva, B.I. Aslanov, A.A. Dolgij, A.E. Goncharov, A.I. Arhangel’skij // Jepidemiologija i infekcionnye bolezni. Aktual’nye voprosy. 2012. no. 1. pp. 9–13.
7. Instrukcija o meroprijatijah po profilaktike i likvidacii psevdomonoza ryb, Minsel’hozprod Rossii, Departament veterinarii, 1998.
8. Katter Je. Bakteriofagi : biologija i prakticheskoe primenenie / Je. Katter, A. Sulakvelidze; per. s angl.: kollektiv per.; nauch. red. rus. izd. A.V. Letarov. Moskva: Nauchnyj mir, 2012. 636 p.
9. Metodicheskie ukazanija po laboratornoj diagnostike psevdomonozov ryb, Minsel’hozprod Rossii, Departament veterinarii, 1998.
10. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Bakterii roda Pseudomonas. Kiev. Naukova dumka, 1990, pp. 176–187.
11. Krylov V. Myoviridae bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa: a long and complex evolutionary pathway / V. Krylov // Res Microbiol. 2003. Vol. 154. pp. 69–75.

Бактерии Pseudomonas fluorescens играют значительную роль в порче пищевого сырья и продовольственных товаров (особенно яиц, мяса, рыбы, молока) [3, 10]. Данный микроорганизм является возбудителем псевдомоноза рыб, распространенного в хозяйствах, применяющих индустриальные методы рыбоводства [1, 4, 7].

Диагностику псевдомонозов рыб в настоящее время проводят путём бактериологических исследований с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений [9]. При типировании возбудителей заболевания до рода Pseudomonas применяется ряд тестов (оксидазная активность, тест окисления-ферментации, определение подвижности, реакция на среде Клиглера), что обуславливает определённую долю недостоверности исследования и длительность от 3,5 до 5 суток [9]. Длительное время объясняется необходимостью применения последовательного пересева на питательные среды, получения чистой культуры и проведения ряда длительных (24 ч) биохимических тестов. Для определения видовой принадлежности возбудителей, проводимой крайне редко, используются методы высевов на среды Гисса (тесты на окисление маннита, сахарозы, мальтозы, лактозы и др.). По современным данным, видовая дифференциация псевдомонад посредством определения ферментативной активности не может давать однозначных результатов [9] и, кроме того, требует длительного времени исследования (от 3,5 до 5 суток). Современные методы, такие как ПЦР и ИФА, требуют наличия дорогостоящего оборудования, расходных материалов, организованной лаборатории и специализированного персонала.

Перечисленные причины обуславливают необходимость в разработке эффективной и недорогой тест-системы для быстрой и точной индикации и идентификации Pseudomonas fluorescens в патологическом материале от рыб и объектов прудов рыбоводческого назначения. В качестве доступного для рыбоводческих хозяйств метода правомерно использовать специфические бактериофаги для проведения реакции нарастания титра фага.

Цель исследования: разработка схем фагоидентификации и фагодетекции P. fluorescens с применением биопрепарата на основе выделенного и изученного бактериофага.

Материалы и методы исследования

Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам С.Н. Золотухина [5], а также E. Kutter [8].

Материалом для исследования при выделении бактериофагов являлись 76 образцов прудовой воды и патологического материала. Штамм P. fluorescens ATCC 13525 использовался в качестве индикаторной бактериальной культуры. Посевы инкубировали при температуре 28 °С в течение 24 часов.

Для получения негативных колоний бактериофагов использовали метод агаровых слоев по Грациа [8]. Повышение литической активности проводили пассированием на индикаторных культурах. Литическую активность определяли по методу Грациа [6]. Для определения спектра действия фагов использовали референс-штаммы P. fluorescens ATCC 13525, В-896, В-970, В-1470 и 28 «полевых» штаммов, выделенных нами из образцов прудовой воды и патологического материала рыб. Для определения специфичности использовали референс-штаммы бактерии P. putida № 901 IV-89; ATCC 12633 IV-87, В-1292, В-899, 33 «полевых» штамма P. putida, выделенных из объектов окружающей среды, 3 референс-штамма бактерии P. aeruginosa № 128, № 381, № 1677, а также штаммы бактерий гетерогенных родов: Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, E. coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Stenotrophomonas maltophila, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами.

Разработку схем фагодетекции и фагоидентификации проводили на основе работ В.Н. Крылова [11], С.Н. Золотухина [5], E. Kutter [8].

Результаты исследований и их обсуждение

В таблице представлены основные биологические свойства выделенных бактериофагов P. fluorescens, на основании которых проводилась их селекция в целях разработки биопрепарата для фагоидентификации и фагодетекции названного вида бактерий. Спектр литической активности представлен на рис. 1.

pic_49.wmf

Рис. 1. Спектр литической активности выделенных бактериофагов.

Основные биологические свойства выделенных бактериофагов P. fluorescens

Свойства

Штаммы бактериофагов P. fluorescens

Pf01F1-

УГСХА

Pf01F2-

УГСХА

Pf01F3-

УГСХА

Pf01F4-

УГСХА

Pf01F5-

УГСХА

Специфичность

P. fl.

P. fl.

P. fl.

P. fl.

P. fl.

Диаметр негативных колоний

1 мм

0,5 мм

0,5 мм

2 мм

1 мм

Литическая активность по Грациа, БОЕ/мл

0,7(±0,1)⋅108

1,2(±0,4)⋅107

0,3(±0,2)⋅108

0,2(±0,1)⋅109

1,5(±0,3)⋅108

Спектр литической активности

86,2 %

72,4 %

62,1 %

82,8 %

72,4 %

Из результатов исследования нами сделан вывод, что штамм бактериофага Pf01F1-УГСХА обладает всеми необходимыми для проведения фагоидентификации и фагодетекции свойствами: титр бактериофага 0,7(±0,1)⋅108 БОЕ/мл, спектр литической активности 86,2 %, специфичность по отношению к бактерии P. fluorescens.

Для проведения фагоидентификации использовали спот-тест [8]. При положительной реакции фагоидентификации на сплошном бактериальном газоне в местах нанесения суспензии бактериофага Pf01F1-УГСХА обнаруживались зоны лизиса (рис. 2). Предложенный метод фагоидентификации с применением суспензии бактериофага Pf01F1-УГСХА отличается простотой выполнения, высокой чувствительностью, специфичностью, скоростью исследования. Недостатком, как и при выполнении классических бактериологических исследований, является необходимость получения чистой культуры исследуемого бактериального штамма.

В результате серии дальнейших исследований была разработана схема фагодетекции методом реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием бактериофага Pf01F1-УГСХА, представленная на рис. 3.

pic_50.tif

Рис. 2. Фагоидентификация бактерий P. fluorescens методом спот-теста (с фагами P. putida Psp1-УГСХА, Psp6-УГСХА, Psp101-УГСХА, P. fluorescens Pf01F1-УГСХА, Pf01F2-УГСХА, Pf01F3-УГСХА, Pf01F4-УГСХА, Pf01F5-УГСХА, P. aeruginosa F4-УГСХА).

pic_51.tif

Рис. 3. Схема фагодетекции P. fluorescens (пояснения по тексту)

Для проведения фагодетекции исследуемый материал (образцы прудовой воды, гомогенизированный патологический материал от рыб, гомогенизированные образцы клинически здоровой рыбы) весом 5 г растирается в фарфоровой ступке и вносится в колбы, содержащие по 50 мл питательного бульона (МПБ). Содержимое колб культивируется в течение 5 часов при 28 °С для предварительного подращивания искомо бактериальной микрофлоры. На каждую исследуемую пробу отводится три пробирки: № 1 – опытная проба, № 2 – контроль на свободный фаг, № 3 – контроль титра индикаторного фага. Исследуемый материал разливается по 9 мл в пробирки № 1 и № 2, пробирка № 3 содержит 9 мл МПБ. В пробирки № 1 и № 3 добавляется по 1 мл препарата бактериофага Pf01F1-УГСХА в рабочем разведении (титр бактериофага 104), а пробирки № 2 – 1 мл МПБ. Все пробы инкубируются в термостате при температуре 28 °С на протяжении 7 часов. После инкубации из пробирок берутся пробы по 0,25 мл, вносятся в пробирки с 4,5 мл стерильного МПБ и обрабатываются фильтрованием через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (Millipore – Millivac). Далее содержимое пробирок исследуется методом агаровых слоев по Грациа. Чашки инкубируются 12 часов при 28 °С.

Реакция считается положительной при нарастании титра бактериофага Pf01F1-УГСХА в 5 и более раз [2, 5, 8].

Выводы: разработанные схемы с использованием бактериофага Pf01F1-УГСХА позволяют проводить фагоидентификацию P. fluorescens после выделения чистой культуры и фагодетекцию в различных объектах без выделения чистой культуры при количестве клеток P. fluorescens от 103 к.о.е./мл. Продолжительность фагоидентификации – 12–18 часов, продолжительность фагодетекции – 24 часа.

Рецензенты:

Нафеев А.А., д.м.н., заведующий отделением особо опасных инфекций, природно-очаговых инфекций и профилактики туберкулеза, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ульяновской области», г. Ульяновск;

Золотухин С.Н., д.б.н., профессор, декан факультета ветеринарной медицины, ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», Ульяновская область, Чердаклинский район, пос. Октябрьский.

Работа поступила в редакцию 26.02.2014.