Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

EXTRACORPOREAL STIMULATION OF AUTOLOGOUS LEUKOCYTES IN CHRONIC PURULENT RHINOSINUSITIS

Egorova E.V. 1 Perestoronin V.I. 1 Tsybikov N.N. 1
1 Chita State Medical Academy, Chita
Предложена оригинальная методика лечения хронического гнойного риносинусита, основанная на предварительной экстракорпоральной активации аутолейкоцитов. Выяснилось, что предлагаемый способ терапии, по сравнению с традиционным лечением, сопровождается быстрой санацией околоносовых пазух у больных с хроническим гнойным риносинуситом (ХГРС). После лечения у пациентов в системном кровотоке увеличивается количество как про-, так и противовоспалительных цитокинов, вследствие активации цитокин-продуцирующих клеток инфекционными агентами, проникающими в сосудистое русло из местного воспалительного очага, а в назальном секрете существенно снижается концентрация IL-1β, IL-6, IL-8. Уровень аутоантител (аАт) к противовоспалительным цитокинам (IL-4, IL-10) возрастает в сыворотке крови, а в назальном секрете, напротив, отмечается снижение уровня аАт к указанным интерлейкинам, что свидетельствует в пользу незначительной местной элиминации противовоспалительных цитокинов на конечных этапах воспалительной реакции. В комплексе выявленные сдвиги могут свидетельствовать о быстром купировании местного воспалительного процесса.
An original technique for treatment of chronic purulent rhinosinusitis, based on pre-activated extracorporealautologous leukocytesis presented. It was determined that the proposed method of treatment, compared with the traditional one, is accompanied by a rapid readjustment of the paranasal sinuses in patients with chronic purulent rhinosinusitis (HPRS). After treatment, in the systemic circulation the number of pro-and anti-inflammatory cytokines is increased, due to activation of cytokine-producing cells by infectious agents that penetrate into the bloodstream from the local inflammatory focus, with the concentration of IL-1β, IL-6 , IL-8 beingreducedsignificantly in nasal secretions. Levels of autoantibodies (AAT) to the anti-inflammatory cytokines (IL-4, IL-10) increases in serum and nasal secretions, on the contrary, there is reduction of the AAT to these interleukins, which contributes tosmallelimination of local anti-inflammatory cytokines in the final stages of the inflammatory reaction. Thus, identified changes may indicate a rapid control of the local inflammatory process.
autologous leukocytes
chronic purulent rhinosinusitis
immunotherapy
1. Kozlov V.S. Rolʹ i znacheniye intranazalʹny khkortikosteroidov v lechenii rinosinusitov // Rossiyskaya rinologiya. 2003. no. 3. pp. 20–24.
2. Lopatin A.S. Ostryy i khronicheskiy rinosinusit: etiologiya, patogenez, klinika, diagnostika i printsipy lecheniya / Lopatin A.S., Gamov V.P. M.: MIA, 2011. 72 p.
3. Mokronosova, M.A. Makrolidy i khronicheskiy rinosinusit / A. Mokronosova, YU.S. Kuyan // Vestnik otorinolaringologii. Meditsinskiy nauchno-prakticheskiy zhurnal. 2010. no. 6. pp. 85–88.
4. Nikolayev M.P. Sovremennyye metody medikamentoznogo i khirurgicheskogo lecheniya rinita i polipoznogo rinosinusita. / M.P. Nikolayev. M. 2000. 12 р.
5. Palʹchun V.T. Ekstrennaya patologiya nosa i okolo nosovykh pazukh / V.T. Palʹchun, N.L. Kunelʹskaya, N.M. Kislova // Vestnikotorinolaringologii. 1998. no. 3. рр. 4–12.
6. Piskunov G.Z. Ostryye i khronicheskiye sinusity // Rossiyskaya rinologiya. 2009. no. 2. pp. 7.
7. Pluzhnikov M.S. Osnovnyye printsipy immuno korrigiruyushchey terapii v otorinolaringologii / M.S. Pluzhnikov, G.V. Lavrenova, Ye.B. Katinas. // Vestnik otorinolaringologii. 2008. no. 2. pp. 38–44
8. Smirnova I.N. Protivovospalitelʹnoye deystviye ingalyatsiy mineralʹnykhvod: tselesoobraznostʹ opredeleniya biokhimicheskikh markerov vospaleniya v nazalʹnomsekrete / I.N. Smirnova, T.N. Zaripova, D.I. Kuzʹmenko // Voprosykurortologii. 2003. no. 4. pp. 20–23.
9. Khaitov R.M. Immunologiya: uchebnik dlya studentov meditsinskikh VUZov. M.: GEOTAR-Media, 2006. – 320 p.
10. Desrosiers MY. Treatment alternatives for chronic rhinosinusitis persisting after ESS: what to do when antibiotics, steroids and surgery fail / M.Y. Desrosiers, S.J. Kilty // Rhinology. 2008. no. 46 (1). pp. 3–14.
11. European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyposis Supplement (EPOS) 2007; 20
12. Legent F. Antibiotic prophylaxis in ORL surgery and oral medicine / F. Legent, J.F Arnould // Ann. Fr. Anesth. Reanim. 1994. no. 13. pp.100–109.

В настоящее время наблюдается прогрессивный рост распространённости заболеваний носа и околоносовых пазух. Воспаление верхнечелюстной пазухи является одной из самых распространенных ЛОР-патологий, как на территории РФ, так и за ее пределами. Так, в России пациенты с гайморитом составляют 20-30 % среди всех госпитализированных в ЛОР-отделения. Еще более значительный удельный вес (до 40 %) занимает синусит среди амбулаторных пациентов ЛОР-кабинетов больниц и поликлиник. Многие исследователи указывают на то, что уровень заболеваемости не имеет тенденции к снижению, лечение проводится не всегда адекватно, растет число случаев острого риносинусита, который переходит в хроническую форму. [1, 2, 4, 5, 6, 11]. Зачастую применяются массивные и длительные курсы антибиотикотерапии, способные вызвать множество осложнений, таких как дисфункция желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и печени, развитие резистентности к патогенным микроорганизмам, аллергические реакции, нефротоксичность, фотосенсибилизацию, эмболию, ототоксичность [7, 12]. Хорошо известно, что лечение больных хроническим гнойным риносинуситом (ХГРС), который плохо поддается или не поддается медикаментозному и хирургическому лечению, является серьезной проблемой, хотя в настоящее время, спектр лечебных мероприятий при данной патологии очень широк и включает антибиотикотерапию, применение деконгестантов, орошение полости носа соляными растворами, использование назальных и системных кортикостероидов [3, 10]. На этом фоне актуальным является поиск способа, позволяющего уменьшить сроки лечения и избежать развития осложнений, связанных с дефектами местного звена иммунитета.

Цель работы - выяснить эффективность предложенного принципа лечения хронического гнойного риносинусита.

Материалы и методы исследования

За основу предлагаемого нами метода лечения был взят запатентованный способ, разработанный Н.Ю. Логиной «Способ лечения хронических рецидивирующих заболеваний слизистой носа и околоносовых пазух методом эндоназальной аутолимфоцитотерапии» (патент RU 2403071 С1), включающий получение аутологичных лимфоцитов из венозной крови больного, их культивирование совместно с иммуномодулятором и введение в придаточные пазухи носа, посредством установленного ЯМИК-катетера, после предварительной эвакуации содержимого. Ввиду сложности и дороговизны процесса получения аутологичных лимфоцитов было предложено некоторое упрощение указанной методики. Ежедневно, на протяжении всего курса лечения, у пациентов в утренние часы забирали кровь из локтевой вены в пробирки с гепарином. В полученные образцы добавляли 0,01 %-й раствор тимогена (10 мкг на 1 мл крови) и инкубировали пробирки в течение часа при комнатной температуре, затем центрифугировали при 1500 об/мин. При помощи микродозатора из пробирок забирали две верхние фракции - плазму крови и слой лейкоцитов, разводили физиологическим раствором в соотношении 1:10 и вводили пациентам в гайморовы пазухи посредством заранее установленных дренажей. Предварительно пазухи промывали 0,9 % раствором натрия хлорида в объеме 20 мл. Необходимо отметить, что описанный способ терапии проводили на фоне продолжающегося, «стандартного» медикаментозного лечения.

Под нашим наблюдением находилось 30 пациентов в возрасте от 16 до 45 лет, проходивших лечение в стационарах г. Читы, которые были разделены на две группы: 15 пациентов, получавших т.н. «традиционную» терапию, включающую системный антибиотик, установку дренажа гайморовой пазухи\пазух с последующим ежедневным промыванием физиологическим раствором; 15 больных, получавших т.н. «оригинальную» терапию, которая заключалась в назначении «традиционной» терапии в сочетании с оригинальной методикой лечения, описанной выше. Контрольную группу составили 10 практически здоровых добровольцев. У здоровых и больных ХГРС после установки диагноза производили забор крови и носового секрета. Для получения смывов из полости носа пациенту в каждый общий носовой ход на 10 минут вводили сухие ватные тампоны, которые после извлечения переносили в пробирку, содержащую 1 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида. Через 30 мин тампоны тщательно отжимали, и полученный смыв использовали для определения уровня цитокинов [8].

Концентрацию цитокинов в сыворотке крови назальном секрете определяли методом ИФА (реактивы фирмы «Вектор-Бест», Новосибирск).

Уровень аутоантител (аАт) к цитокинам определяли оригинальным способом: лунки полистироловых планшетов сенсибилизировали антигенами: IL-1β; IL-2; IL-6; IL-8; IL-10; IF-α (реактивы фирмы «Вектор-Бест», Новосибирск) в количестве 20 мкг в объеме 200 мкл забуференного физиологического раствора (рН 7,4). После этого лунки планшетов трижды отмывали дистиллированной водой и вносили исследуемую жидкость (сыворотка крови, назальный секрет). После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре лунки планшетов вновь отмывали дистиллированной водой и вводили реактивы тест-систем («Вектор-Бест», Новосибирск) для выявления IgG в сыворотке крови и IgAs в назальном секрете.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета программ «BIOSTAT».

Результаты исследования и их обсуждение

Течение местного гнойно-воспалительного процесса отражается на балансе цитокинов в сыворотке крови (табл. 1)

Таблица 1

Содержание цитокинов в сыворотке крови больных ХГРС до и после лечения

Параметры, пг/мл

Здоровые n = 10

ХГРС до лечения

n = 30

ХГРС после лечения n = 30

традиционное

оригинальное

IL-1β

1,3 (0,7; 1,6)

8,0 (3,5; 12,3)

36,9

(30,1; 49,3)

110,6

(97,1; 156,3)

IL-2

18,3 (15,4; 29,2)

0,00

11,4

(9,1; 12,7)

22,91

(13,95;34,38)

IL-4

0,00

0,5 (0,3; 0,8)

2,6

(2,1; 3,3)

9,91

(6,09;11,2)

IL-6

1,2 (1,0; 1,7)

3,3 (0,1; 9,5)

15,1

(13,8; 17,6)

42,44

(25,83;63,69)

IL-8

32,6 (28,4; 41,7)

18,7 (6,2; 24,9)

40,9

(36,4; 47,9)

34,55

(20,2;125,2)

IL-10

9,3 (7,1; 13,4)

0,00

14,8

(13,1; 17,4)

11,65

(10,19;16,35)

IF-α

2,1 (1,8; 2,6)

5,1 (2,1; 5,9)

20,2

(18,5; 23,7)

69,13

(34,72;87,35)

Прямая зависимость между уровнем IL-2 и IL-10 и уровнем аАт класса IgG к ним в сыворотке крови больных ХГРС свидетельствует о потреблении этих групп цитокинов и их элиминации указанными аАт. Как видно из табл. 1 и 2, как в сыворотке крови, так и особенно в назальном секрете у больных увеличивается концентрация IL-1β, IL-4, IL-6 и IF-α по сравнению с группой контроля. Уменьшается концентрация IL-8. Следует обратить внимание на то, что в сыворотке крови больных не определяются IL-2 и IL-10, в то время как в назальном секрете эти цитокины регистрируются 0,18 ± 0,07 и 0,62 ± 0,39 пг/мл соответственно (табл. 2). Полученные факты свидетельствуют о возможности проникновения интерлейкинов из местного воспалительного очага в общий кровоток.

Таблица 2

Содержание цитокинов в назальном секрете больных ХГРС до и после лечения

Параметры, пг/мл

Здоровые n = 10

ХГРС до лечения

n = 20

ХГРС после лечения n = 20

традиционное

оригинальное

IL-1β

25,0 (18,4;42,8) р < 0,05

53,1 (10,1; 223,7)

174,5

(168,1; 186,4)

1,84

(1,6; 2,98)

IL-2

0,00

0,14 (0,07; 0,2)

9,1

(8,3; 10,2)

19,16

(15,77; 21,08)

IL-4

0,6 (0,4; 0,8)

0,3 (0,2; 0,7)

0,7

(0,5; 0,9)

1,096

(0,58;1,55)

IL-6

11,7 (9,1; 17,6) р < 0,05

223,1 (216,6; 228,7)

91,8

(87,7; 98,1)

35,49

(27,88;39,05)

IL-8

204,5 (142,3; 261,8)

224,3 (191,9; 265,5)

100,6

(97,1; 110,9)

7,362

(4,057;14,98)

IL-10

0,5 (0,4; 0,9) р < 0,05

0,6 (0,4; 0,9)

3,3

(2,9; 3,8)

3,039

(2,64;8,63)

IF-α

1,4 (1,2; 1,9) р < 0,05

6,5 (3,2; 9,7)

17,6

(15,4;22,8)

65,74

(51,65;72,34)

У пациентов, получавших «традиционную» терапию, повышается уровень всех определяемых цитокинов в сыворотке крови и IL-1β, IL-2, IL-4, IL-10, IF-α в назальном секрете. Таким образом, видим, что традиционная терапия сопровождалась повышением уровня как про-, так и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови, и в назальном секрете.

При оригинальном способе лечения регистрировали еще большее увеличение концентрации про- и антивоспалительных цитокинов, как в сыворотке крови, так и назальном секрете (см. табл. 1, 2). Выявленные сдвиги позволяют заключить, что предварительная активация клеток крови тимогеном с последующим их введением в воспаленные пазухи носа сопровождается более быстрым увеличением уровня провоспалительных цитокинов и клиническим улучшением. У больных, которых лечили оригинальным методом, гайморовы пазухи были санированы на 3-5 сутки, в то время как традиционная терапия давала положительный эффект на 7-8 день. Вероятно, инкубация крови с тимогеном сопровождалась активацией иммунокомпетентных клеток, что в последующем при введении активированных лейкоцитов в околоносовые пазухи приводило к их быстрой санации.

Концентрация IL-1β в назальном секрете у больных ХГРС увеличивается практически в 8 раз, также значительно возрастает уровень IL-2, IL-6, IL-8, IF-α. Следует отметить, что при ХГРС содержание IL-4 и IL-10 уменьшается, что, вероятно, связано с потреблением этой группы цитокинов и их элиминацией антителами класса sIgA.

Таким образом, цитокиновый профиль в назальном секрете подвергается более резким изменениям, нежели чем в системном кровотоке, что свидетельствует о преимущественно местном образовании про- и противовоспалительных цитокинов и в целом отражает степень остроты воспалительного процесса.

В специальных исследованиях мы изу­чали динамику уровня аАт и различных антигенов на фоне лечения ХГРС традиционными и оригинальными методами. Следует сразу указать, что в сыворотке крови исследовались аАт класса IgG, а в назальном секрете sIgА. Полученные данные приведены в табл. 3 и 4.

Как следует из представленных данных, уровень аАт класса IgG к IL-1β, IL-2, IL-4, IL-10, IF-α увеличивался в сыворотке крови как на фоне «традиционного», так и на фоне «оригинального» лечения. Такой сдвиг может свидетельствовать в пользу специфического иммунного ответа к данным интерлейкинам, и, следовательно, усилению их элиминации из организма. На наш взгляд, такая реакция может отображать интенсивность саногенетических реакций, направленных на уменьшение степени воспаления. Выявлено, что концентрация аАт к противовоспалительным цитокинам (IL-4, IL-10) возрастает в сыворотке крови, как при «традиционном», так и при «оригинальном» методах лечения. В назальном секрете, напротив, отмечается снижение уровня аАт к указанным интерлейкинам, что может свидетельствовать в пользу незначительной элиминации insitu противовоспалительных цитокинов в финале воспаления. Уровень аАт к IF-α после лечения уменьшается в назальном секрете и увеличивается в сыворотке крови.

Таблица 3

Содержание аАт к цитокинам в сыворотке крови больных ХГРС до и после лечения

Параметр

Здоровые

Больные ХГРС

Традиционная терапия

Оригинальная терапия

аАт класса IgG к IL-1β

0,9

(0,7; 0,12)

0,11

(0,08; 0,22)

0,14

(0,13; 0,28)

0,17

(0,13; 0,3)

аАт класса IgG к IL-2

0,08

(0,06; 0,09)

0

0,1

(0,08; 0,12)

0,15

(0,11; 0,18)

аАт класса IgG к IL-4

0

0,08

(0,05; 0,1)

0,08

(0,08; 0,13)

0,09

(0,07; 0,16)

аАт класса IgG к IL-6

0,11

(0,9; 0,15)

0,13

(0,09; 0,23)

0,14

(0,11; 0,18)

0,1

(0,07; 0,25)

аАт класса IgG к IL-8

0,2

(0,18; 0,27)

0,23

(0,15; 0,26)

0,2

(0,16; 0,24)

0,12

(0,09; 0,22)

аАт класса IgG к IL-10

0,19

(0,15; 0,21)

0

0,2

(0,17; 0,23)

0,08

(0,07; 0,37)

аАт класса IgG к IF-α

0

0

0,1

(0,08; 0,14)

0,11

(0,09; 0,29)

Таблица 4

Содержание аАт к цитокинам в назальном секрете больных ХГРС до и после лечения

Параметр

Здоровые

Больные ХГРС

Традиционная терапия

Оригинальная терапия

аАт класса sIgА к IL-1β

0,1

(0,07; 0,18)

0

0,12

(0,11; 0,19)

0,16

(0,13; 0,23)

аАт класса sIgА к IL-2

0

0,2

(0,13; 0,21)

0,16

(0,15; 0,23)

0,14

(0,12; 0,17)

аАт класса sIgА к IL-4

0,14

(0,12; 0,16)

0,06

(0,05; 0,09)

0,05

(0,03; 0,08)

0,076

(0,06; 0,079)

аАт класса sIgА к IL-6

0,26

(0,24; 0,31)

0,11

(0,09; 0,13)

0,1

(0,08; 0,11)

0,08

(0,07; 0,09)

аАт класса sIgА к IL-8

0,15

(0,13; 0,19)

0,19

(0,14; 0,22)

0,17

(0,12; 0,19)

0,11

(0,09; 0,17)

аАт класса sIgА к IL-10

0,12

(0,1; 0,16)

0,21

(0,02; 0,3)

0,05

(0,04; 0,1)

0,011

(0,01; 0,02)

аАт класса sIgА к IF-α

0,31

(0,25; 0,39)

1,0

(0,8; 1,5)

0,008

(0,001; 0,01)

0,097

(0,09; 0,1)

Приведенные данные позволяют с большей долей вероятности указывать на роль аАт во взаимодействии с цитокинами в патогенезе местного воспаления. Таким образом, динамические сдвиги содержания аАт в сыворотке крови при использовании предлагаемого принципа лечения ХГРС носят более консолидированный характер, чем в назальном секрете, и в сочетании с однонаправленными изменениями уровня исследуемых цитокинов свидетельствуют о возможности регуляции их количества посредством образования иммунных комплексов с их последующей элиминацией. Динамика уровня аАт в назальном секрете на фоне «оригинальной» терапии, напротив, носит разнонаправленный характер, что также может свидетельствовать о наличии механизмов регуляции с участием местно-синтезированных аАт и высокой скорости протекания указанных процессов.

Заключение

Нами установлено, что предлагаемый способ терапии, по сравнению с традиционным лечением, сопровождается быстрой санацией ОНП у больных с ХГРС. Следует еще раз указать, что при предложенном способе лечения у больных увеличивается количество как про-, так и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови, а в назальном секрете существенно снижается концентрация IL-1β, IL-6, IL-8. Подобные сдвиги могут свидетельствовать о быстрой санации местного воспалительного процесса. Однако в системном кровотоке уровень цитокинов продолжает оставаться высоким и, вероятнее всего, отражает реакцию цитокин-продуцирующих клеток, активированных различными триггерами, резорбированными в кровоток из очага гнойного поражения.

Рецензенты:

Кузник Б.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВО ЧГМА Минздравсоцразвития Российской Федерации, г. Чита;

Степанов А.В., д.м.н., заведующий кафедрой безопасности жизнедеятельности и медицины катастроф ГБОУ ВПО ЧГМА Минздравсоцразвития Российской Федерации, г. Чита.

Работа поступила в редакцию 03.12.2012.