Известно, что обширная ожоговая рана и обусловленные ею висцеральные изменения находятся в тесной взаимосвязи и взаимодействии [7]. Развитие синдрома системного воспалительного ответа при ожоговой болезни сопровождается дисбалансом между активностью радикал-продуцирующей и антиоксидантной системами, что приводит к избытку свободных радикалов, играющих роль циркулирующих «патологических сигналов» и участвующих в поражении внутренних органов [5]. Перекисное окисление липидов сказывается в первую очередь на состоянии клеточных мембран, белков – на состоянии ферментов. В то же время основными ферментами, участвующими в утилизации ряда продуктов пероксидации, являются альдегиддегидрогеназа (АлДГ) и алькогольдегидрогеназа (АДГ). Целью данной работы явилось исследование активности АлДГ, АДГ как маркеров биотрансформации, а также интенсивности процессов липопероксидации в печени, легких, сердце и почках животных с термической травмой.
Материалы и методы исследований
Исследования проводились на 30 крысах мужского пола линии Wistar массой 200–250 г. Животные были разделены на следующие группы: первая группа – контрольная, которую составили интактные крысы (n = 15), вторая группа – опытная (n = 15). Животным опытной группы в условиях общей анестезии эфиром наносили ожог II–III степени кипятком на депилированных от шерсти 20 % поверхности тела [1]. Крыс выводили из эксперимента на третьи, седьмые и десятые сутки после ожога под эфирным наркозом, извлекали печень, почки, сердце и легкие. В полученных гомогенатах органов исследовали параметры свободнорадикального окисления (СРО) и активность оксидоредуктаз.
Активность процессов СРО изучали с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции [4] на биохемилюминометре БХЛ-07 (Н. Новгород). Оценивались следующие параметры хемилюминограммы: tg 2α – показатель, характеризующий скорость спада процессов свободнорадикального окисления в плазме и свидетельствующий об антиоксидантном потенциале (АОП); S – светосумма хемилюминесценции за 30 с – отражает потенциальную способность биологического объекта к свободнорадикальному окислению. Уровень малонового диальдегида (МДА) в гомогенате органов оценивался по методу M. Uchiyama и M. Mihara [9].
Активность альдегиддегидрогеназы (АлДГ) определяли по Б.М. Кершенгольцу и Е.В. Серкиной (1981) [2], алкогольдегидрогеназы в прямой и обратной реакции (АДГпр. и АДГобр.) по M. Koivusalo е.а. [8].
Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.
Результаты исследования и их обсуждение
В гомогенате печени опытной группы животных интенсивность индуцированной хемилюминесценции, характеризующая способность к генерации свободных радикалов, осталась без значительных изменений. В то же время зарегистрировано значительное повышение уровня МДА на 7 сутки после травмы – на 57 % (p < 0,05), с возвращением к исходному уровню на 10 сутки (табл. 1). Активация процессов СРО в печени сдерживалась адаптивным увеличением системы антиоксидантной защиты: на 3 сутки показатель хемилюминограммы, характеризующий АОП, достигал 124 % (p < 0,05), на 7 сутки – 118 %, на 10 сутки – 136 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Наблюдаемые явления можно объяснить следующим образом. Основной причиной свободнорадикального поражения клеточных мембран, как гепатоцитов, так и клеток других тканей организма, являются нарушения центральной и периферической гемодинамики, реологических свойств крови, вследствие чего происходит блок печеночной циркуляции и ишемия [7]. В печени обожженных животных отмечалось достаточно быстрое включение (на 3 сутки после травмы) перестройки в метаболизме, проявляющейся в компенсаторной активации антиоксидантной защиты, не дающей развиться окислительному стрессу. Рост АОП имеет большое значение еще и по той причине, что в случае её недостаточности в печени может происходить срыв системы детоксикации [6].
Выявлено статистически значимое снижение удельной активности альдегиддегидрогеназы в печени на 3-и сутки после травмы – на 56,2 %, на 7-е сутки – на 78,1 % и на 10-е сутки после травмы – на 41,4 %. Столь выраженное уменьшение активности АлДГ может способствовать накоплению большого количества токсичных альдегидов (не только малонового), которые, в свою очередь, ингибируя активность многих ферментов, снижают детоксикационную функцию печени. Можно предположить, что наблюдаемое нами явление связано с увеличением содержания других высокотоксичных соединений, в частности молекул средней массы (МСМ), которые переводят фермент в новое конформационное состояние, характеризуемое снижением его сродства к субстрату реакции. Кроме того, МСМ оказывают значительное влияние на процессы ПОЛ [3]. Вероятно, что с этим связано отмеченное увеличение концентрации продукта липопероксидации – МДА.
Таблица 1
Динамика показателей хемилюминесценции и активности оксидоредуктаз в гомогенате печени обожженных животных
Сутки после ожога |
S, усл. ед |
tg2α, усл. ед. |
МДА, ед. опт. пл. |
АлДГ нмоль НАДН/мин∙мг белка |
АДГпр. нмоль НАДН/мин∙мг белка |
АДГобр. нмоль НАДН/мин∙мг белка |
Инт. крысы |
1935,37 ± 83,73 |
124,63 ± 8,10 |
8,37 ± 0,52 |
51,39 ± 1,75 |
47,39 ± 2,55 |
107,90 ± 3,03 |
3 сут |
1839,80 ± 129,24 |
154,10 ± 5,41* |
7,53 ± 0,79 |
22,49 ± 1,30* |
34,72 ± 1,02* |
89,95 ± 5,49* |
7 сут |
1712,60 ± 46,65 |
146,50 ± 8,15 |
13,15 ± 0,69* |
11,25 ± 0,84* |
17,05 ± 1,19* |
66,63 ± 4,53* |
10 сут |
1907,40 ± 23,63 |
169,10 ± 8,59* |
8,32 ± 0,52 |
30,10 ± 3,46* |
25,82 ± 1,55* |
86,12 ± 3,24* |
Примечание. * – различия статистически значимы по сравнению с интактными крысами.
Биотрансформация альдегидов связана не только с работой фермента альдегиддегидрогеназы, но и с алкогольдегидрогеназой. При накоплении альдегидов может происходить смещение направления реакции, катализируемой этими ферментами, в сторону их восстановления до менее токсичных спиртов. Удельная активность АДГобр. статистически значимо уменьшалась на 16,6 % на 3-и сутки, на 38,3 % на 7-е и на 20,2 % на 10-е сутки после ожогового повреждения. Максимальное снижение активности наблюдалось на седьмые сутки после ожога. Активность фермента в прямой реакции также снижалась на 26,7 % на 3-и сутки, на 64 % на 7-е сутки и на 45,5 % на 10-е сутки после ожога по сравнению с контрольной группой крыс (р < 0,05).
В результате проведенных исследований интенсивности перекисного окисления липидов в гомогенате почек получены следующие результаты. Значения светосуммы хемилюминесценции снижались одновременно с продуктами ПОЛ. МДА на 7 сутки составлял 60 % от исходной величины (p < 0,05). Значение tg2α, характеризующее антиоксидантный потенциал, к 3 и 7 суткам увеличилось в среднем на 18 %, к 10 суткам – на 44 % (p < 0,05) по отношению к контролю (табл. 2). Таким образом, в почках, как и в печени, наблюдалось превалирование АОП над процессами липопероксидации.
Удельная активность АлДГ в почках статистически значимо возрастала на третьи и десятые сутки на 21,8 и 45,5 % соответственно по сравнению с активностью фермента контрольной группы животных. Отмеченный нами факт повышения антиоксидантного потенциала и увеличения активности данного фермента в почках свидетельствует о возрастании детоксикационной нагрузки на этот орган. Выявлено значительное падение активности обратной реакции алкогольдегидрогеназы. Этот факт, вероятно, может быть связан с увеличением активности другого ключевого фермента биотрансформации альдегидов – АлДГ: незначительное увеличение активности альдегиддегидрогеназы (на 21,8 % на 3-и сутки) при резком уменьшении активности АДГобр (на 74 % на 3-и сутки). На 7-е сутки активность АДГобр уменьшалась на 69,4 % (p < 0,05). Если же рост активности АлДГ становился более значительным к 10-м суткам наблюдения (на 45,5 %), то падение активности АДГобр было менее выражено (на 31,5 %) (табл. 2).
Активность АДГпр в почках статистически значимо увеличивалась: в 2 раза на 3-и сутки, в 1,9 раза на 7-е и в 2,8 раза на 10-е сутки после ожога. Таким образом, в данном органе мы наблюдаем разнонаправленные изменения в реакциях алкогольдегидрогеназы: рост активности фермента в прямой реакции сопровождается уменьшением активности обратной реакции.
Проведенные исследования в гомогенате легких у животных опытной группы показали изменения светосуммы хемилюминесценции: на 3-е сутки после моделирования ожоговой травмы зафиксировано ее незначительное возрастание по сравнению с аналогичным параметром у интактных животных, на 7-е сутки данный показатель увеличился на 35 %, на 10-е сутки на 38 % (табл. 3). Повышение концентрации свободных радикалов вызывает вазоконстрикцию капилляров легких, которая сопровождает явления развивающегося травматического стресса, ведет к гипоксемии и усугубляет нарушения свободнорадикальных процессов [7]. Активацию СРО подтверждает выявленное нами резкое увеличение промежуточного продукта липопероксидации – МДА, максимально выраженное на 7 сутки после травмы до 153 % (p < 0,05) по отношению к контролю. К 10 суткам данный показатель имел тенденцию к снижению, но все же превышал значения интактных животных на 87 % (p < 0,05). Таким образом, дезадаптивно повышенный уровень МДА может быть дополнительным маркером острого паренхиматозного поражения легких.
Таблица 2
Динамика показателей хемилюминесценции и активности оксидоредуктаз в гомогенате почек обожженных животных
Сутки после ожога |
S, усл. ед |
tg2α, усл. ед. |
МДА, ед. опт. пл |
АлДГ, нмоль НАДН/мин∙мг белка |
АДГпр., НАДН/мин∙мг белка |
АДГобр., НАДН/мин∙мг белка |
Инт. крысы |
1414,4 ± 122,0 |
52,67 ± 5,06 |
10,02 ± 1,06 |
80,50 ± 5,55 |
15,25 ± 1,04 |
48,68 ± 2,99 |
3 сут |
1277,40 ± 40,87 |
62,38 ± 1,39 |
8,18 ± 0,79 |
98,04 ± 6,71* |
32,61 ± 2,85* |
12,91 ± 1,71* |
7 сут |
1291,50 ± 70,78 |
62,13 ± 3,15 |
5,96 ± 0,51* |
87,05 ± 8,27 |
29,29 ± 1,27* |
14,91 ± 0,98* |
10 сут |
1297,40 ± 42,00 |
75,70 ± 1,45* |
8,18 ± 0,50 |
117,10 ± 9,25* |
49,48 ± 1,14* |
33,36 ± 1,14* |
Примечание. * – различия статистически значимы по сравнению с интактными крысами.
Таблица 3
Динамика показателей хемилюминесценции и активности оксидоредуктаз в гомогенате легких обожженных крыс
Сутки после ожога |
S, усл. ед |
tg2α, усл. ед. |
МДА, ед. опт. пл. |
АлДГ, нмоль НАДН/мин∙мг белка |
АДГпр., НАДН/мин∙мг белка |
АДГобр., НАДН/мин∙мг белка |
Инт. крысы |
880,56 ± 45,75 |
33,28 ± 1,83 |
3,44 ± 0,004 |
22,61 ± 2,10 |
84,13 ± 3,87 |
122,10 ± 8,85 |
3 сут |
891,20 ± 75,69 |
22,50 ± 0,63* |
7,3 ± 0,33* |
14,46 ± 1,79* |
96,38 ± 12,15 |
50,44 ± 4,77* |
7 сут |
1191,00 ± 59,64 |
47,10 ± 1,28* |
8,7 ± 0,83* |
10,07 ± 0,83* |
64,90 ± 3,82* |
67,40 ± 1,62* |
10 сут |
1218,40 ± 76,89 |
66,95 ± 3,11* |
6,43 ± 0,48* |
22,10 ± 1,20* |
72,80 ± 2,75* |
60,47 ± 1,49* |
Примечание. * – различия статистически значимы по сравнению с интактными крысами.
По данным индуцированной биохемилюминесценции антиоксидантный потенциал в легких был снижен на 3 сутки после травмы на 32 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Наблюдаемое нами усиление перекисных процессов в этот период (увеличение количества МДА на 114 %, тенденция к возрастанию светосуммы хемилюминесценции) на фоне значимого угнетения антиоксидантной системы свидетельствовало о развитии окислительного стресса. В дальнейшем показатель АОП увеличился на 42 % (p < 0,05) на 7 сутки. К концу срока наблюдения исследуемый показатель возрос 101 % (p < 0,05) по сравнению с уровнем интактных животных.
Выявлено, что удельная активность альдегиддегидрогеназы в легких статистически значимо снижалась к 3-м суткам после ожога на 36,1 %, к 7-м суткам на 55,5 % (p < 0,05). Обращает на себя внимание тот факт, что эти изменения происходили параллельно с накоплением малонового диальдегида, что косвенно свидетельствовало о субстратном ингибировании данного фермента детоксикации. К концу срока наблюдения за экспериментальными животными отмечено возрастание активности изучаемого фермента до значений контрольной группы. Выявленное увеличение АОП и активности АлДГ можно объяснить адекватными адаптационными перестройками в метаболизме, свидетельством чему является снижение к 10 суткам уровня МДА.
В результате проведенных исследований нами также было выявлено, что у обожженных животных светосумма хемилюминесценции в гомогенате сердца снижалась по сравнению с интактной группой крыс. Наиболее выраженно это происходило на 7 сутки после травмы (снижение на 36 %) (табл. 4).
На 10 сутки показатель светосуммы был снижен на 26 %. Концентрация малонового диальдегида на третьи сутки после травмы статистически значимо снижалась на 59 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой, что в совокупности может свидетельствовать о недостаточности системы биологического окисления. К седьмым сутками отмечалось усиление перекисных процессов, что отражалось в возрастании концентрации МДА, не превышающей, однако, значений контрольной группы. На 10-е сутки произошло незначительное снижение уровня исследуемого метаболита. Общая антиоксидантная активность в исследуемом органе имела тенденцию к снижению на 7 и 10 сутки в среднем на 15 % и наряду с падением интенсивности процессов пероксидации свидетельствовала о напряжении окислительно-восстановительных процессов миокарда.
Таблица 4
Динамика показателей хемилюминесценции и активности оксидоредуктаз в гомогенате сердца обожженных животных
Сутки после ожога |
S, усл. ед. |
tg2α, усл. ед. |
МДА, ед. опт. пл. |
АлДГ, нмоль НАДН/мин∙мг белка |
АДГпр., нмоль НАДН/мин∙мг белка |
АДГобр., нмоль НАДН/мин∙мг белка |
Инт. крысы |
827,80 ± 36,05 |
31,00 ± 1,78 |
6,82 ± 0,79 |
15,55 ± 1,43 |
17,40 ± 1,95 |
65,86 ± 2,18 |
3 сут |
661,60 ± 27,62* |
31,70 ± 1,24 |
4,00 ± 0,60* |
13,00 ± 2,13 |
11,49 ± 2,80 |
15,46 ± 1,41* |
7 сут |
545,84 ± 20,40* |
25,45 ± 0,90 |
6,93 ± 0,27 |
16,20 ± 1,89 |
8,52 ± 0,32* |
25,48 ± 2,72* |
10 сут |
610,60 ± 37,10* |
27,00 ± 1,64 |
6,17 ± 0,50 |
26,45 ± 1,67* |
18,46 ± 0,43 |
17,53 ± 1,28* |
Примечание. * – различия статистически значимы по сравнению с интактными крысами.
Удельная активность АлДГ в сердце на 3-и и 7-е сутки оставалась в пределах диапазона значений интактных животных. Повышение исследуемого параметра, а следовательно, вовлечение этого фермента в процесс биотрансформации альдегидов в данном органе, было отмечено к 10-м суткам после травмы – на 70,1 %. Вполне вероятно, что уменьшение уровня МДА в этот период связано с активацией альдегиддегидрогеназы, вовлеченной в процесс утилизации альдегидов. Удельная активность АДГобр. уменьшается на 76,5 % на третьи сутки, на 61,3 % на седьмые сутки и на 73,4 % на десятые сутки после термической травмы, косвенно указывая на накопление высокотоксичного ацетальдегида. Наблюдаемое снижение активности данного фермента также может свидетельствовать о напряжении окислительно-восстановительных процессов.
Отмечается тенденция к снижению удельной активности АДГ в прямой реакции на 3-и сутки после травмы, на 7-е сутки зарегистрировано статистически значимое уменьшение (на 51,1 %). Падение активности АДГпр. ведет к накоплению токсичного эндогенного этанола. К концу срока наблюдения нами было отмечено возрастание исследуемого показателя практически до значений интактных животных, что может быть связано с компенсаторными конформационными перестройками в белковых молекулах.
Заключение
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования на модели термического поражения показали системность и органоспецифичность биохимических сдвигов, которые проявились в различной степени выраженности изменений активности оксидоредуктаз и нарушении баланса между действием прооксидантных факторов и антиоксидантной системы защиты. Отмечены угнетение свободнорадикальных процессов в почках и сердце и активация в печени и легких. Эти изменения сочетались с компенсаторной активацией антиоксидантной защиты печени, легких и почках обожженных животных и недостаточностью в сердце. Выявлены разнонаправленные изменения активности АлДГ: наибольшая общая активность АлДГ отмечена в почках, наименьшая – в легких. Согласно полученным результатам, удельная активность АДГобр статистически значимо снижалась в исследованных органах во все сроки наблюдения. Активность алкогольдегидрогеназы в прямой реакции снижалась во всех органах, кроме почек.
Полученные экспериментальные данные в тканях исследованных внутренних органов лабораторных животных позволяют уточнить механизмы патогенеза развития полиорганной недостаточности при ожоговой болезни.
Рецензенты:Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета, ФГБОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных, ФГБОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 02.03.2015.
Библиографическая ссылка
Костина О.В., Соловьева А.Г., Ларионова К.Д. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ПРО- И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМ И АКТИВНОСТИ ОКСИДОРЕДУКТАЗ В ЖИЗНЕННО ВАЖНЫХ ОРГАНАХ НА МОДЕЛИ ТЕРМИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 2-5. – С. 960-964;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36964 (дата обращения: 17.08.2024).