Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Герасимова Н.А. 1 Евстигнеева Н.П. 1 Зильберберг Н.В. 1 Гущин А.Е. 2

---

1 ФГБУ «Уральский НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии» Минздрава России

2 ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора

В работе представлены результаты одномоментного обследования 228 пациенток и 526 пациентов с субъективными и объективными симптомами воспалительного процесса урогенитального тракта на M. hominis и Ureaplasma spp. двумя методами – культурально-биохимическим и ПЦР в режиме реального времени (ПЦР РВ) в качественном формате. При обследовании на M. hominis и Ureaplasma spp. положительные результаты совпали (истинно-положительные результаты) у женщин в 7,0 и 35,9 %, у мужчин в 3,4 и 22,2 %. Дискордантные результаты в среднем регистрировались в (170/754) 22,5 % случаев. Общая частота диагностических случаев с дискордантными результатами у женщин составила (72/228) 31,6 %, у мужчин (98/526) 18,6 %, рассмотрены возможные причины. Специфичность культурально-биохимического метода относительно качественного формата ПЦР РВ при выявлении Ureaplasma spp. составила 95,7 %, при выявлении M. hominis у мужчин составила 99,7 %, у женщин ниже – 97,3 % (p ≤ 0,01). Чувствительность культурально-биохимического метода при выявлении Ureaplasma spp. у мужчин составила 80,1 %, у женщин – 71,9 % (p ≤ 0,01). Чувствительность культурально-биохимического метода при выявлении M. hominis у мужчин составила 25,7 %, у женщин – 34,8 % (p ≤ 0,01).

Статья в формате PDF

324 KB

инфекционно-воспалительные заболевания репродуктивных органов

культуральные и ПЦР методы диагностики Mycoplasma hominis

Ureaplasma spp.

1. Ведение больных инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенитальными инфекциями / под ред. А.А. Кубановой // Клинические рекомендации, Российское общество дерматовенерологов и косметологов. – М.: Деловой Экспресс, 2012. – С. 74–78.

2. Герасимова Н.А., Евстигнеева Н.П., Гущин А.Е. Диагностические аспекты количественной оценки урогенитальных микоплазм // Молекулярная диагностика, 2014: Всероссийская научно-практическая конференция. – М., 2014. – Т. 1. – С. 176–177.

3. Долгова Т.И., Румянцева Т.А., Гущин А.Е. Сравнение информативности биологического материала, полученного из цервикального материала и влагалища, при обследовании пациенток гинекологического профиля на генитальные инфекции // Молекулярная диагностика, 2014: Всероссийская научно-практическая конференция М., 2014. – Т. 1. – С. 156–157.

4. Евстигнеева Н.П., Кунгуров Н.В., Зильберберг Н.В. Идентификация условно-патогенной микрофлоры методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI TOF MS) у пациентов с неспецифическими уретритами // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2014. – № 5. – С. 48–53.

5. Евстигнеева Н.П., Кузнецова Ю.Н., Рахматулина М.Р., Михайлова О.О. // Врач. – 2011. – № 6. – С. 7–12.

6. Кунгуров Н.В., Евстигнеева Н.П., Кузнецова Ю.Н., Зильберберг Н.В., Сергеев А.Г. Микоплазменные инфекции урогенитального тракта. – Курган: Зауралье, 2010. – 132 с.

7. Савичева А.М., Шипицына Е.В., Башмакова М.А.. Генитальные микоплазмы – проблемы диагностики и лечения // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 6. – С. 80–90.

8. Аmirmozafari N., Mirnejad R., Kamezi B., Saribi E., Bojari M.R., Darkabi F.D. Comparison of polymerase chain and culture for detection of genital mycoplasma in clinical samples from patients with genital infection // Saudi Med. J. – 2009. – Vol. 30, № 11. – P. 1401–1405.

9. Choe H.S., Lee D.S., Lee S.J., Hong S.H., Park D.C., Lee M.K., Kim T.H., Cho Y.H. // Int J Infect Dis. – 2013. – Vol. 17, № 12. – Р. 1134–40.

10. Redelinghuys M.J., Ehlers M.M., Dreyer A.W., Lombaard H.A., Kock M.M. Comparison of the new Mycofast Revolution assay with a molecular assay for the detection of genital mycoplasmas from clinical specimens // BMC Infectious Diseases. – 2013. – Vol. 13. – P. 453.

11. Shahin N.P., Roghayeh S. Comparison of culture with the polymerase chain reaction for detection of gennital Mycoplasma // European Journal of General Medicine. – 2008. – Vol. 5. № 2. – Р. 107–111.

12. Waites K. B., Xiao L., Paralanov V., Viscardi R.M., Glass J.I. // The Journal of Molecular Diagnostics. – 2012. – Vol. 14, № 5. – Р. 437–450.

13. Xiao L., Glass J.I., Paralanov V., Yooseph S., Cassell G.H., Duffy L.B., Waites K.B. // Clin Microbiol. – 2010. – Vol. 48. – P. 2715–2723.

Современной особенностью инфекционно-воспалительных заболеваний органов репродуктивной системы является возрастающая роль условно-патогенных микроорганизмов, треть из которых составляет семейство Mycoplasmataceae. Высокая частота выявления Ureaplasma spp., M. hominis у лиц репродуктивного возраста, отсутствие патогномоничных симптомов, нередко бессимптомное течение повышает актуальность своевременной и точной лабораторной диагностики, адекватного лечения, предотвращающего развитие осложнений [1, 5, 6, 7]. Согласно клиническим рекомендациям Российского общества дерматовенерологов (2012), верификация диагноза заболеваний, вызванных Ureaplasma spp. и Mycoplasma hominis, основывается на результатах лабораторных исследований молекулярно-биологическими методами, направленными на обнаружение специфических фрагментов ДНК Ureaplasma spp. и M. hominis, или культурального исследования с выделением и идентификацией [1].

Молекулярно-биологические методы по чувствительности и специфичности выявления Ureaplasma spp. и M. hominis превосходят культуральные методы, что убедительно показано многими исследователями [9, 12]. В настоящий момент доступен количественный формат ПЦР в режиме реального времени, который позволяет обнаруживать ДНК урогенитальных микоплазм в линейном диапазоне 10³–10⁷ ГЭ/мл, рассчитать количество клеток возбудителя относительно клеток слизистой оболочки человека, а также по концентрации ДНК человека контролировать качество взятия клинического материала.

В бактериологических лабораториях практического здравоохранения для диагностики микоплазменной инфекции применяются культурально-биохимические тесты, основанные на изменении цвета индикатора в щелочной среде при гидролизе субстратов мочевины и аргинина жидкой питательной среды до аммиака. Необходимо учитывать, что чувствительность метода составляет 10⁴ КОЕ/мл, а изменение цвета индикатора не является строго специфичной реакцией и может происходить также в присутствии бактерий, проявляющих уреазную активность, при щелочной реакции пробы с клиническим материалом.

Современная таксономическая классификация семейства Mycoplasmataceae включает в составе рода Ureaplasma два вида – U. urealyticum и U. parvum. U. urealyticum связывают с негонококковыми уретритами (НГУ) у мужчин, с возникновением ВЗОМТ, случаями внутриутробной гибели плода. U. parvum детектируется при вагинитах, пиелонефритах, отягощенном акушерско-гинекологическом анамнезе [13]. Встречаемость U. urealyticum и U. parvum при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта, степень патогенности, влияние на репродуктивную функцию изучаются. Типирование урогенитальных уреаплазм до видов U. parvum и U. urealyticum осуществляется только методами амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), культурально-биохимические тесты выявляют Ureaplasma spp., нередко указывая U. urealyticum, что увеличивает долю несопоставимых результатов, затрудняет анализ публикаций научных исследований. Одномоментное исследование отделяемого урогенитального тракта культуральным и молекулярно-биологическим методами (ПЦР в режиме реального времени – ПЦР РВ) при совпадении дает истинно-положительный или истинно отрицательный результат. Нередко регистрируются дискордантные результаты, что осложняет интерпретацию.

Цель исследования – оценить частоту дискордантных результатов диагностических методов (ПЦР РВ и культуральных) при выявлении Ureaplasma spp. и M. hominis.

Материалы и методы исследования

Проведено клинико-лабораторное обследование 754 пациентов (526 мужчин и 228 женщин), с субъективными и объективными симптомами воспалительного процесса урогенитального тракта, консультативного приема УрНИИДВиИ на M. hominis и Ureaplasma spp. одномоментно двумя методами – ПЦР РВ и культуральным. Критерием включения в исследование являлись клинические и/или лабораторные признаки воспалительного процесса урогенитального тракта, при отсутствии патогенных возбудителей. Диагностическим критерием, подтверждающим наличие уретрита, являлось обнаружение 5 и более полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в поле зрения в мазках из уретры мужчин. Наличие вагинита подтверждалось соотношением ПЯЛ к клеткам плоского эпителия более 1. Биологический материал для исследования получали у женщин из заднего свода влагалища, у мужчин – из уретры урогенитальными универсальными, одноразовыми зондами с ворсовым покрытием. Зонды помещали в пробирки с транспортной средой для культурального, ПЦР РВ методов, транспортную среду Amies (Италия) для идентификации микрофлоры.

В работе использованы методы: культурально-биохимический (Mycoplasma IST 2, BioMerieux, (n = 269 мужчин, 82 женщин), Mycofast Evolution 3, EliTech MicroBio (n = 257 мужчин, 146 женщин) и ПЦР РВ (наборы реагентов качественного формата «АмплиСенс C. trachomatis/Ureaplasma/M. genitalium/M. hominis Мультипрайм-FL» (n = 754), набор реагентов количественного формата «АмплиСенс» U. parvum, U. urealyticum, M. hominis Флороценоз/Микоплазмы-FL» (n = 62 женщин) (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва).

В табл. 1 представлена характеристика ПЦР РВ и культурально-биохимического метода*.

Идентификация микрофлоры проводилась на микробиологическом анализаторе VITEK MS MALDI-TOF, BioMerieux, методом времяпролетной масс-спектрометрии. Интерпретация результатов осуществлялась с использованием базы данных VITEK MS, состоящей из расширенного классификатора спектров рибосомальных белков клинически значимых видов.

При расчете диагностической чувствительности (ДЧ) и диагностической специфичности (ДС) культурально-биохимического метода в качестве референсного выбран метод ПЦР РВ.

Статистическая обработка электронной базы данных Excel проводилась с помощью программ Microsoft Excel 2007, MedСalc (демо-версия).

Результаты исследования и их обсуждение

Частота выявления Ureaplasma spp. у пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями (n = 754) с клиническими и /или лабораторными признаками воспалительного процесса урогенитального тракта методом ПЦР РВ составила 34,5 % (ДИ 30,4–38,9), M. hominis – 15,4 % (ДИ 12,7–18,5), культурально-биохимическим Ureaplasma spp. – 29,2 % (ДИ 25,5–33,3), M. hominis – 5,0 % (ДИ 3,6–6,9). Частота выявления Ureaplasma spp. и M. hominis методом ПЦР РВ значительно выше, чем культуральным (р ≤ 0,05, р ≤ 0,001). Молекулярно-биологические методы по чувствительности и специфичности выявления Ureaplasma spp. и M. hominis превосходят культуральные методы, что убедительно показано при обследовании пациенток с гинекологическими заболеваниями, бесплодием, беременных [8, 10, 11]. Высокая чувствительность и специфичность молекулярно-биологического метода позволяет считать результаты ПЦР РВ метода истинно положительными. К достоинствам ПЦР РВ также относится способность выявлять микроорганизмы вне зависимости от их ростовых свойств, поскольку микоплазмы, лишенные клеточной стенки, чувствительны к смене условий окружающей среды и при транспортировке могут лишаться способности к культивированию.

Таблица 1

Характеристика методов диагностики M. hominis и Ureaplasma spp.

Примечание. * в таблице представлены данные согласно инструкции производителей.

Частота выявления Ureaplasma spp. в урогенитальных образцах пациенток с жалобами и/или объективными симптомами воспалительного процесса урогенитального тракта методом ПЦР РВ составила 50,0 % (ДИ 41,2–60,1), M. hominis – 20,2 % (ДИ 14,8–26,9), бактериологическим методом Ureaplasma spp. – 38,2 % (ДИ 30,6–47,1) и M. hominis – 8,3 % (ДИ 5,0–13,0). При типировании уреаплазм методом ПЦР РВ в режиме реального времени в соскобах из урогенитального тракта пациенток ДНК U. urealyticum выявлена в 22,7 % (ДИ 17,8–29,1 %) случаев, ДНК U. parvum – 70,5 % (ДИ 61,4–80,9 %), ДНК обоих видов уреаплазм выявлялась в 6,8 % (ДИ 4,1–10,4 %) случаев. Частота выявления Ureaplasma spp. из урогенитальных образцов пациентов молекулярно-биологическим методом составила 27,8 % (ДИ 23,4–32,6), M. hominis – 13,3 % (ДИ 10,3–16,8), культуральным методом Ureaplasma spp. – 25,3 % (ДИ 21,2–29,9) и M. hominis – 3,6 % (ДИ 2,2–5,6). Таким образом, двумя методами ПЦР РВ и культуральным показано значительное превалирование частоты выявления у женщин Ureaplasma spp. (p ≥ 0,001) и M. hominis (p ≥ 0,01), чем у мужчин, что может быть объяснено высокой информативностью и обсемененностью биологического материала, получаемого от пациенток [3].

Дискордантные результаты при определении урогенитальных микоплазм в среднем регистрировались в (170/754) 22,5 % (ДИ 19,3–26,2) случаев. Дискордантные результаты ПЦР РВ положительный/культуральный отрицательный отмечались в 84,1 % (143/170) случаев, при выявлении M. hominis в (82/170) 48,2 %, Ureaplasma spp. (61/170) 35,9 %. В положительных образцах пациенток определяли концентрацию ДНК микоплазм ПЦР РВ в количественном формате. Средняя концентрация ДНК M. hominis и Ureaplasma spp. при отрицательных результатах культурального метода составляла 6•10² ГЭ/мл и 3•10² ГЭ/мл соответственно, что находится за пределами порога чувствительности культурально-биохимического метода.

Дискордантные результаты, отрицательные в ПЦР РВ, положительные культуральным методом, регистрировались в 15,9 % (27/170) случаев: при выявлении M. hominis в 3,5 % (6/170), Ureaplasma spp. в 12,4 % (21/170). Такие результаты требуют подтверждения путем высева на плотные селективные питательные среды. Достоверно чаще у пациентов с дискордантными результатами (отрицательными в ПЦР РВ, положительными культуральным методом) по сравнению с конкордантными выявлялись представители сем. Streptococcaceae, Micrococcaceae, гемоглобинофильных бактерий рода Haemophilus, обладающие ферментативной активностью по отношению к мочевине и/или аргинину, р ≤ 0,05. По резистентности штаммов микроорганизмов к антибактериальным препаратам эти две группы не отличались.

Частота дискордантных результатов при молекулярно-биологическом и культурально-биохимическом исследовании на Ureaplasma spp. и M. hominis представлена в табл. 2.

Таблица 2

Результаты исследований пациентов на M. hominis и Ureaplasma spp. ПЦР РВ и культуральным методами

Примечания:

*достоверные различия в двух независимых группах при p ≤ 0,05;

**достоверные различия в двух независимых группах при p ≤ 0,01;

***достоверные различия в двух независимых группах при p ≤ 0,001.

По гендерному признаку дискордантные результаты регистрировались у каждого пятого пациента (18,6 %) (ДИ 15,3–22,7) и у трети обследованных пациенток (31,6 %) (ДИ 24,7–39,8). У женщин достоверно чаще регистрировались дискордантные результаты ПЦР РВ положительный/культуральный отрицательный при выявлении Ureaplasma spp., чем у мужчин 14,0 % (32/228) и 5,5 % (29/526) соответственно (p ≤ 0,001). Это, очевидно, связано с тем, что у пациенток исследуемой группы титр Ureaplasma spp. был низкий для изменения цвета индикатора в лунках культурально-биохимического метода.

При обследовании женщин на M. hominis также чаще зарегистрированы случаи положительных результатов культурально-биохимического тестирования, при отрицательном результате ПЦР 2,2 % (5/228), по сравнению с мужчинами 0,2 % (1/526), p ≤ 0,01. При масс-спектрометрическом исследовании микробного спектра урогенитального тракта пациентов, по нашим данным, достоверно чаще у женщин, чем у мужчин, выявлялись представители семейства Enterobacteriaceae, обладающие ферментативной активностью к мочевине, и в разной степени к аргинину (25,2 и 9,2 % соответственно) [4], а также при инфекции Ureaplasma spp. (U. parvum и/или U. urealyticum), которые в концентрации ≥ 10⁸ КОЕ/мл могут изменять цвет индикатора в лунках идентификации M. hominis культурально-биохимического метода [2].

Проведено сопоставление данных с исследованием Redelinghuys M., 2013 (кафедра медицинской микробиологии, университет Претории, Ю. Африка) [10] беременных женщин консультативного приема, обследованных на Ureaplasma spp., M. hominis аналогичными методами – Mycofast Evolution 3 и ПЦР в реальном времени. Отмечена сопоставимая частота дискордантных результатов ПЦР РВ положительный культуральный отрицательный (17,8 и 18,0 % соответственно) при выявлении Ureaplasma spp. и не сопоставимые при выявлении M. hominis. Исследование Redelinghuys M. подтверждает наличие дискордантных результатов положительного культурального теста при отрицательном ПЦР РВ и превышает наши данные, хотя достоверных различий не выявлено (табл. 3).

Таблица 3

Сравнение дискордантных результатов ПЦР РВ и культурального метода Мycofast с исследованием Redelinghuys M.

Примечания: * достоверные различия в двух независимых группах при p ≤ 0,05;

** достоверные различия в двух независимых группах при p ≤ 0,01;

*** достоверные различия в двух независимых группах при p ≤ 0,001.

Специфичность культурально-биохимического теста относительно качественного формата ПЦР РВ при выявлении Ureaplasma spp. составила 95,7 %, при выявлении M. hominis у мужчин составила 99,7 %, у женщин ниже – 97,3 % (p ≤ 0,01). Чувствительность культурально-биохимического метода при выявлении Ureaplasma spp. у мужчин составила 80,1 %, у женщин – 71,9 % (p ? 0,01), чувствительность культурально-биохимического метода при выявлении M. hominis у мужчин не превышала 25,7 %, у женщин – 34,8 % (p ≤ 0,01).

Выводы

Частота выявления Ureaplasma spp. и M. hominis у пациентов с урогенитальными заболеваниями методом ПЦР РВ достоверно выше, чем культуральным (р ≤ 0,05, р ≤ 0,001).

Двумя методами - ПЦР РВ и культуральным - показано значительное превалирование частоты выявления у женщин Ureaplasma spp. (p ≥ 0,001) и M. hominis (p ≥ 0,01), чем у мужчин.

Дискордантные результаты при определении урогенитальных микоплазм в среднем регистрировались в 22,5 % (170/754) случаев. Дискордантные результаты ПЦР РВ положительный культуральный отрицательный отмечались в 84,1 % (143/170) случаев в образцах с концентрацией ДНК микоплазм за пределами порога чувствительности культурально-биохимического метода (≤ 10³ КОЕ/мл). Согласно клиническим рекомендациям РОДВ (2012), показанием к проведению лечения является наличие клинико-лабораторных признаков инфекционно-воспалительного процесса, при котором не выявлены другие, более вероятные возбудители.

Дискордантные результаты, ПЦР РВ отрицательный культуральный положительный, регистрировались в 15,9 % (27/170) случаев: при выявлении M. hominis в 3,5 % (6/170), Ureaplasma spp. в 12,4 % (21/170). Такие результаты носят сомнительный статус и требуют подтверждения на плотных селективных средах с выявлением морфологических особенностей колоний микоплазм.

Рецензенты:

Лысенко О.В., д.м.н., профессор кафедры дерматовенерологии, ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России, г. Челябинск;

Глазкова Л.К., д.м.н., профессор кафедры дерматовенерологии, ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург.

Работа поступила в редакцию 25.09.2014.

Библиографическая ссылка