В настоящее время для хирургического лечения заболеваний, связанных с окклюзией кровеносных сосудов, большой интерес представляют тканеинженерные сосудистые графты [6]. Одним из перспективных подходов тканевой инженерии к созданию кровеносного сосуда является его выращивание на биодеградируемом полимерном графте in vivo [9]. Существуют различные методы изготовления полимерных сосудистых графтов. Однако выбор того или иного метода в значительной степени оказывает влияние на прочность и структуру конечного продукта. С одной стороны, идеальный искусственный графт должен обладать механическими свойствами, соответствующими нативным артериям. С другой стороны, он также должен имитировать морфологию внеклеточного матрикса, что может быть обеспечено высокопористой поверхностью из микро- и нановолокон [11].
Одним из методов, привлекающих внимание в решении данной проблемы, является электроспиннинг растворов и расплавов полимеров. Метод электроспиннига позволяет изготавливать трехмерные высокопористые полимерные матриксы, состоящие из микро- и нановолокон [12]. Для электроспиннига могут быть использованы природные деградируемые материалы, такие как коллаген, гиалуроновая кислота или фибриноген [2, 1, 7]. К сожалению, эти полимеры обладают низкой прочностью и чаще используются в качестве покрытий для синтетических сосудистых протезов. Синтетические же деградируемые полимеры, такие как большинство алифатических полиэстеров, сополимер молочной и гликолиевой кислот, а также производные карбонатов, хотя и используются в качестве биоматериалов и систем доставки лекарственных препаратов, но достаточно быстро теряют механическую прочность в результате ускоренной биодеградации in vivo [13]. В отличие от упомянутых синтетических полимеров, поликапролактон (poly(ɛ-caprolactone) (PCL)) известен хорошими механическими свойствами, и механизм его деградации in vivo обусловлен медленным гидролитическим процессом, что делает этот материал наиболее приемлемым для изготовления сосудистых графтов [3].
Известно, что физико-механические свойства и поверхность материала, изготовленного методом электроспиннинга, напрямую зависят от множества параметров, связанных со свойствами полимера, растворителя, условий среды и самого процесса. Но особое влияние на морфологию и прочность оказывает изменение таких параметров как напряжение и концентрация полимера в растворе [8].
В связи с чем целью данной работы стало определение оптимальных параметров электроспиннинга для изготовления сосудистого графта, а также его испытания in vivo с помощью имплантации в брюшную аорту крыс.
Материалы и методы исследования
Для изготовления сосудистых графтов использовали синтетический биодеградируемый полимер поликапролактон с молекулярной массой 80 000 (Sigma-Aldrich Co. LLC, США).
Изготовление сосудистых PCL-графтов. Сосудистые PCL графты диаметрами 2 мм и толщиной 100-120 мкм изготавливали методом электроспиннинга на установке Nanon-01A (MECC CO, Япония). В работе изучали несколько режимов работы элетроспиннинга: концентрации растворов полимера в хлороформе – 10 %, 12 %, 14 % и 16 %, напряжение на конце иглы 15 кВ и 25 кВ. Скорость подачи полимерного раствора составляла 1 мл/ч, расстояние до коллектора – 15 см, в качестве коллектора использовали вращающийся штифт диаметром 2 мм. Далее проводили сравнение изготовленных сосудистых графтов по показателям физико-механических свойств и морфологии.
Физико-механические свойства сосудистых графтов. Физико-механические испытания PCL-графтов проводили с использованием универсальной испытательной машины «Zwick/roell» – 2.5Н (Германия) в соответствии с ГОСТ 270-75. Для точности измерений к образцам применяли предварительную нагрузку – 0,01 Н. Прочность оценивали по максимальному напряжению при растяжении, упруго-деформативные свойства – по относительному удлинению до нарушения целостности образца и модулю упругости (Емод). Для оценки физико-механических свойств сосудистых графтов было исследовано в группе протезов из чистого PCL 80 образцов, по 10 в каждой серии.
Морфология сосудистых графтов. Для изучения диаметра волокон и поверхности на образцы PCL-графтов наносили золотое токопроводящее покрытие толщиной в 30 нм и далее изучали на сканирующем электронном микроскопе S3400N (Hitachi, Япония).
Имплантация сосудистых графтов из PCL в аорту крыс. Графты диаметром 2 мм имплантировали в брюшную часть аорты крыс. Самцов крыс линии Wistar массой 400–450г (n = 5) вводили в наркоз 3 % изофлураном, далее операцию проводили при ингаляционном наркозе 1,5 % изофлурана. Аорту выделяли и пережимали ниже почечной артерии и выше уровня бифуркации. Проксимальный и дистальный анастомозы выполняли по типу «конец в конец» с использованием шовного материала 9-0. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания. Проходимости графтов оценивали с помощью ультразвукового исследования с допплерометрией через 1, 3, 5, 7 и 10 месяцев после имплантации. Через 10 месяцев животных выводили из эксперимента, графт выделяли вместе с прилежащими участками аорты. PCL-графт и зоны анастомозов оценивали методом световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилином-эозином и по Ван-Гизон.
Статистические методы. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США). Нормальность распределения оценивали при помощи критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, а также непараметрического дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Данные представлены в виде медианы и 25-ый и 75-ый процентилей (25 % < М < 75 %).
Результаты исследования и их обсуждение
Поскольку сосудистые графты устанавливаются в кровеносное русло, то важное значение имеют их физико-механические свойства. Проведенные испытания показали, что наибольшую прочность (p < 0,05) имели PCL графты из 14 % раствора – 2,64 Н/мм2 при 15 кВ и 3,09Н/мм2 при 25 кВ, а также образцы из 16 % раствора полимера – 2,34 н/мм2 при напряжении 15 кВ и 3,41 Н/мм2 при 25 кВ (таблица). Наименьшую прочность продемонстрировали образцы из 10 % PCL при 15 кВ – 0,34 Н/мм2. При этом не наблюдалось достоверных отличий между графтами, изготовленными при 15 кВ и 25 кВ (p > 0,05).
Оценка упруго-деформативных свойств PCL графтов показала изменение эластичности материала с возрастанием концентрации полимера. Относительное удлинение при максимальном напряжении для графтов, изготовленных в режиме 15 кВ, возрастало от 108,97 % для концентрации 10 % до 669,17 % и 564,72 % для 14 % и 16 % растворов соответственно. Похожие различия наблюдались также между графтами, изготовленными при подаваемом напряжении в 25 кВ. При этом не отмечали достоверных различий (p > 0,05) в относительном удлинении между графтами одной концентрации PCL, но изготовленными при разных значениях напряжения.
Также важной характеристикой для материала, имплантируемого в организм, является его упругость, то есть способность возвращать прежнюю форму после деформации. Упругость материала характеризуется модулем Юнга. Результаты проведенного исследования не показали отличий по упругости материала между всеми группами сосудистых графтов из PCL (p > 0,05). Для образцов из высоких концентраций PCL 14 и 16 % (15 кВ) среднее значение модуля Юнга в пределах физиологического давления составило 1,92 и 2,0 Н/мм2 соответственно, а для образцов, изготовленных при 25 кВ, – 1,65 и 2,01 Н/мм2.
Физико-механические свойства сосудистых графтов из PCL
|
Концентрация полимера |
Напряжение, кВ |
Прочность, МПа (25 % < М < 75 %) |
Относительное удлинение, % (25 % < М < 75 %) |
Емод, Н/мм2 (25 % < М < 75 %) |
|
PCL 10 % |
15 |
0,30 < 0,34 < 0,40 |
108,97 < 108,97 < 120,35 |
0,74 < 0,74 < 1,05 |
|
25 |
1,49 < 1,57 < 1,75 |
168,84 < 249,89 < 262,86 |
1,74 < 2,07 < 2,42 |
|
|
PCL 12 % |
15 |
2,15 < 2,35 < 2,44 |
315,42 < 478,48 < 739,36 |
1,42 < 1,81 < 2,33 |
|
25 |
1,81 < 1,96 < 2,48 |
261,64 < 304,96 < 345,28 |
0,94 < 1,13 < 1,92 |
|
|
PCL 14 % |
15 |
2,40 < 2,64* < 2,81 |
589,16 < 669,17* < 849,14 |
1,41 < 1,92 < 2,13 |
|
25 |
2,75 < 3,09** < 3,49 |
588,27 < 609,2** < 632,19 |
1,56 < 1,65 < 1,95 |
|
|
PCL 16 % |
15 |
2,27 < 2,34* < 2,88 |
488,63 < 564,72* < 632,65 |
1,90 < 2,00 < 2,84 |
|
25 |
3,23 < 3,41** < 3,42 |
604,59 < 617,12** < 638,14 |
1,93 < 2,01 < 2,51 |
Примечания:
* – p < 0,05 по сравнению с PCL 10 % при 15 кВ
** – p < 0,05 по сравнению с PCL 10 % и 12 % при 25 кВ.
Следует отметить, что средние показатели физико-механических свойств для биологических сосудистых протезов, изготовленных из грудной артерии крупного рогатого скота, составляют: прочность – 1,26 МПа, относительное удлинение – 95,9 %, модуль Юнга – 0,28 Н/мм2. Следовательно, сосудистые графты из PCL превосходят по прочности и эластичности сосудистым протезам, используемым для замещения пораженных артерий.
Полученные данные демонстрировали значительное влияние концентрации полимера в растворе на физико-механические свойства графтов. В то же время, напряжение, подаваемое на полимер при проведении электроспиннинга, не оказывало существенного влияния на прочность и эластичность протезов. Хорошие прочностные и упруго-деформативные свойства имели сосудистые графты из 14 и 16 % PCL.
Изучение PCL-графтов с помощью сканирующей электронной микроскопии показало изменение поверхности материала с увеличением концентрации полимера. Средний диаметр волокон при напряжении 15 кВ составил 446 нм, 1,78 мкм, 2,01 мкм, 2,74 мкм и при 25 кВ – 84 нм, 1,12 мкм, 2,62 мкм, 2,68 мкм для концентраций 10, 12, 14 и 16 % соответственно (Рис 1). Полученные результаты свидетельствовали об увеличении диаметра волокна с возрастанием концентрации раствора PCL.
Рис. 1. Зависимость диаметра волокна от концентрации PCL при напряжении электроспиннинга 15 и 25 кВ * – p<0,05 относительно 10 и 12% PCL при 15 и 25 кВ ** – p<0,05 относительно 14% PCL при 15 кВ
Кроме того, волокна из 10 % раствора PCL имели большое количество утолщений, так называемых «бусин» как на образцах, изготовленных при напряжении 15 кВ, так и 25 кВ. В свою очередь в графтах из 12 % полимера дефекты были менее выражены. А на образцах из 14 % и 16 % PCL утолщений и других ярко выраженных нарушений структуры волокон не наблюдалось. Полученные результаты согласуются с данными исследований процесса электроспиннинга, представленных в ряде работ. Концентрация оказывает влияние на вязкость и поверхностное натяжение раствора, поэтому при недостаточной концентрации полимера во время электроспиннинга формируются капли, которые при высыхании полимерной нити образуют утолщения на волокне [10]. Следовательно в данном исследовании оптимальную морфологию имели сосудистые графты из 14 и 16 % PCL. При этом волокна с меньшим диаметром имели образцы, изготовленные при 15 кВ.
Размер волокна от десятков нанометров до нескольких микрометров имеет важное значение в создании тканеинженерных конструкций, так как волокна графта должны имитировать фибриллярные белки, входящие в состав внеклеточного матрикса, например коллаген. Волокна с меньшим диаметром образуют большую поверхность взаимодействия, что способствует лучшему прикреплению клеток, а также обеспечивает транспорт питательных веществ и удаление продуктов метаболизма. В то же время, волокна, имеющие наноразмеры, образуют очень мелкие поры и тем самым могут препятствовать инфильтрации материала клетками [10]. Вероятно, наиболее предпочтительными для клеток будут графты, состоящие из микроволокон. Но при этом их диаметр не должен превышать 2 мкм, так как клеткам необходимо иметь возможность ориентироваться вокруг волокон и прикрепляться к ним, а размер большинства клеток лежит в диапазоне 2–120 мкм [8, 4].
На основании результатов физико-механических испытаний и сканирующей электронной микроскопии можно заключить, что сосудистый PCL графт, изготовленный из 14 % раствора полимера при 15 кВ, обладает высокой прочностью и эластичностью, и оптимальным диаметром волокна по сравнению с графтами, имеющими подобные физико-механические свойства, но сделанными в других режимах электроспиннинга. Данный сосудистый графт был выбран для проведения дальнейших исследований.
Сосудистые графты с внутренним диаметром 2 мм имплантировали в брюшную часть аорты крыс для оценки возможности их практического использования, функциональности, а также биосовместимости. Оптимизированные PCL графты продемонстрировали удобство в имплантации и прочное удерживание шовного материала. Результаты ультразвукового мониторинга через 1, 3, 5, 7 и 10 месяцев после имплантации демонстрировали проходимость всех протезов. При этом зоны проксимального и дистального анастомозов визуализировались лишь в срок до 2 месяцев после операции. В дальнейшем перепад диаметров протеза и нативной аорты нивелировался. За период наблюдения не было выявлено стенотических и аневризматических изменений, как самого графта, так и зон анастомозов.
Рис. 2. PCL-графт, 10 месяцев после имплантации в брюшную аорту крысы. 1,2 – окараска гематоксилин и эозин. 3, 4 – окраска по Ван-Гизон. a – стенка графта, b – тромб в зоне анастомоза, c – волокна коллагена
При макроскопическом исследовании эксплантированных графтов не было обнаружено кровотечений и видимых повреждений стенки. Это позволяет предположить, что графт из PCL не подвергается деформациям, обусловленным деградацией полимера, и способен функционировать в гемодинамических условиях in vivo достаточно длительное время. Гистологический анализ образцов показал наличие тромба в зоне анастомоза с его последующей организацией во всех случаях (рис. 2). Вероятной причиной тромбообразования может быть несоответствие диаметров графта и аорты, так как диаметр аорты крысы не достигает 2 мм, что приводит к нарушению гемодинамики в зоне анастомоза и образованию турбулентных потоков крови [5].
Стенка графта во всех случаях была полностью инфильтрирована макрофагами и миофибробластами. При этом участков острого воспаления не наблюдалось. Клеточная инфильтрация сопровождалась деградацией полимера и накоплением межклеточного вещества, о чем свидетельствуют волокна коллагена и эластина, расположенные по всей толщине и длине графта. Наличие структурных компонентов на PCL-графте, характерных для кровеносного сосуда, свидетельствует о формировании новой сосудистой стенки.
Заключение
Проведенные в данной работе исследования по оптимизации параметров электроспиннинга для создания сосудистого графта из PCL показали, что лучшими свойствами обладает протез, изготовленный из 14 % полимера при 15 кВ.
Результаты эксперимента in vivo демонстрировали заселение стенок PCL-графта, изготовленного методом электроспиннинга, клетками с образованием новой ткани. Способность графта функционировать достаточно длительный период – до 10 месяцев, делает его перспективной основой для выращивания кровеносных сосудов. Тем не менее, учитывая возможное образование тромбов в зонах анастомоза, необходима антитромботическая модификация протеза, а также подбор оптимальной экспериментальной модели с использованием животных с более крупными кровеносными сосудами, чтобы исключить перепад диаметра в зоне анастомоза.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00050) в ФГБУ НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН.
Рецензенты:
Григорьев Е.В., д.м.н., профессор, заместитель директора по научной и лечебной работе ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН, г. Кемерово;
Иванов С.В., д.м.н., заведующий лабораторией реконструктивной хирургии мультифокального атеросклероза ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН, г. Кемерово.
Работа поступила в редакцию 25.08.2014.
Библиографическая ссылка
Севостьянова В.В., Головкин А.С., Филипьев Д.Е., Глушкова Т.В., Борисов В.В., Бураго А.Ю., Барбараш Л.С. ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ЭЛЕКТРОСПИННИНГА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СОСУДИСТОГО ГРАФТА МАЛОГО ДИАМЕТРА ИЗ ПОЛИКАПРОЛАКТОНА // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10-1. – С. 180-184;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35237 (дата обращения: 23.11.2024).