В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что потребности комплексного лечения обусловливают необходимость точной этиологической диагностики заболеваний людей пожилого возраста и четкого достоверного понимания патогенетических сдвигов [1, 3, 4].
Одной из проблемных областей с точки зрения таргетности в гериатрии является гериатрическая гастроэнтерология в целом, и проблемы ведения пожилых людей с хроническим гастритом в частности. Это связано с тем, что довольно значительное количество пациентов в пожилом возрасте имеет сочетание инфицирования Helicobacter pylori (НР) и герпес-вирусами, однако клинико-морфологические особенности сочетанной инфекции изучены в малой степени [2, 5, 6, 7].
Цель работы – определить перпесктивы использования таргетного подхода к диагностике и лечению в гериатрии (на примере ведения пожилых пациентов с хроническим гастритом).
Материалы и методы исследования
Мы провели обследование 200 лиц среднего возраста от 40 до 59 лет (мужчин – 132 чел., женщин – 68 чел., средний возраст 46,2 + 3,3 года) и 180 пациентов пожилого возраста от 60 до 74 лет (мужчин – 116 чел., женщин – 64 чел., средний возраст 65,8 + 2,8 года) страдающих хроническим гастритом, верифицированным морфологически. Проведенные пациентам исследования соответствуют этическим нормам Хельсинской декларации (2000 г.) и Приказу Министерства здравоохранения РФ № 266 от 19.06.2003 г. На первом этапе рандомизация пациентов проходила в пределах клинической базы исследования, пациенты отбирались для исследования методом случайной выборки и стратифицировались по диагнозу «хронический гастрит» путем его установления эндоскопическим способом. В обследование не включались лица с хроническим гастритом (ХГ) на фоне язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и рака желудка, пациенты с воспалительными заболеваниями кишечника, целиакией, больные с хроническими заболеваниями дыхательной, сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем в стадии декомпенсации. Для повышения достоверности дыхательных тестов исключались пациенты, имевшие хронические неспецифические заболевания легких и хроническую почечную недостаточность. На этом этапе проведен весь комплекс клинических исследований, а также инвазивная и неинвазивная диагностика хеликобактериоза.
Изучены биоптаты от пациентов с морфологически верифицированным хроническим гастритом. Проведено серологическое исследование на герпес-вирусы у пациентов с позитивной иммуногистохимической (ИГХ) реакцией на герпес-вирусы.
Серологическая диагностика герпес-инфекции проводилась следующим образом. Антитела IgG–EA–EBV и IgM–NA–EBN определялись методом ИФА с помощью стандартных наборов фирмы «Вектор Бест». Расчет проводился по уровню негативного контроля, который с расчетом серой зоны составил для антител класса IgG в экстинциях-0,452, а для антител класса IgM-в экстинциях-0,502. Величины выше этих показателей свидетельствовали о наличии антител.
Антитела к герпесу 1 и 2 типов и цитомегаловирусу определялись специальной оригинальной модифицированной реакцией связывания комплемента (РСК), совмещающей в себе реакцию связывания комплементов с ферментным тестированием реакции на конечном этапе [О.А. Аксенов и соавт. патент № 2034025].
Электронно-микроскопическое исследование биоптатов слизистой оболочки желудка. Для электронно-микроскопического исследования биоптаты тела и антрального отдела желудка фиксировали в 2,5 % глютаральдегиде с последующей дофиксацией 1 % раствором четырехокиси осмия и заливали в аралдит-М. Ультратонкие срезы получали в ультратоме LKB-3 и изучали в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL).
Иммуногистохимические исследования биоптатов слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки. Для проведения иммуногистохимических реакций из парафиновых блоков готовились срезы толщиной 3 мкм, переносились на предметные стекла, покрытые L-полилизином (Sigma). Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный протокол.
Для выявления вирусных антигенов в качестве первых антител использовали поликлональные антитела к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов (DAKO), моноклональные антитела к раннему антигену цитомегаловируса и моноклональные антитела к латентному мембранному протеину ВЭБ (Novocastra). Для оценки апоптоза и пролиферации в качестве первичных специфических антител использовали моноклональные антитела (Novocastra – RTU-p53-DO7, RTU-bcl-2, RTU-Ki-67-MM1, 1:25-CPP32 JHM62), а для оценки цитокинового статуса – моноклональные антитела к CD-4, CD-8, CD-15, CD-16, CD-21, CD-56 (все Novocastra, 1:100). В качестве вторичных антител и визуализирующей системы применяли Novostain Universal Detection Kit («Novocastra», NCL-RTU-D). Докраску ядер осуществляли гематоксилином.
Экспрессию вирусных антигенов в слизистой оболочке оценивали по наличию светло- и темно-коричневых гранул в структурах слизистой оболочки желудка при микроскопическом исследовании в обычном световом микроскопе. Применялась полуколичественная шкала оценки интенсивности (0 – отсутствие, 1 – слабая, 2 – умеренная, 3 – выраженная). При этом поле зрения считалось пригодным для данной оценки признака при наличии в нем не менее 60 % позитивно окрашенных клеток. Исследования проводили с положительным и отрицательным контролями. Оценка апоптоза и цитокинового статуса проводилась с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений (Nikon). Морфологические изображения, поступающие через оптическую систему микроскопа Nikon Eclipse 400 (увеличение х 320: объектив 40, окуляр 10, фильтр 0,8) регистрировались цифровой цветной видеокамерой Nikon DXM1200, вмонтированной в тубус микроскопа и передавались в компьютер Pentium-4.
Статистическая обработка результатов исследования. Полученные в ходе работы данные регистрировались в специально разработанной таблице, включающей паспортную часть, анамнез заболевания и сопутствующие болезни, клиническое течение заболевания, данные объективного и лабораторно-инструментальных методов обследования, а также показатели специальных методов обследования. Массив исходных данных был подготовлен так, что можно было сравнивать весь имеющийся набор сведений в анализируемых группах и подгруппах разного уровня.
Статистическая обработка материалов исследования осуществлялась на персональном компьютере IBM PC (Intel Pentium-III), Windows Millenuim с помощью программных средств и пакета Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., США). Для оценки гипотезы нормальности распределения имеющихся выборок данных использовали критерий Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента с оценкой достоверности различий (p < 0,05) по значениям M ± m. Для оценки достоверности различий независимых выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, применяли непараметрический критерий Манна-Уитни, для зависимых выборок данных использовали критерий Вилкоксона. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05. Для сравнения средних показателей количественных признаков в исследуемых группах использовался t-критерий Стьюдента с оценкой достоверности различий (p < 0,05) по значениям M ± m. При оценке связей качественных показателей применяли критерий достоверности связи (p < 0,05)c χ2 Пирсона, χ2 с поправкой Йетса, критерий Фишера. Для выявления статистических связей между признаками в ряде случаев использовали корреляционный анализ. Измерение корреляционной зависимости осуществляли с использованием ранговой корреляции по Пирсону и Спирмену. Различия и корреляции считали достоверными при р < 0,05. Для решения задачи классификации признаков по качественному (группирующему) показателю, а также для ранжирования признаков по степени влияния на этот показатель использовался линейный пошаговый дискриминантный анализ с использованием стандартного пакета программы SPSS (14 версия). Включение признаков в дискриминантные уравнения и их ранжирование основывалось на величине F-критерия Фишера. Отнесение наблюдения к той или иной группе осуществлялось путем вычисления дискриминантных сумм для каждой из групп и определения максимальной суммы.
Результаты исследования и их обсуждение
Возрастные отличия в состоянии клеточного иммунитета при хроническом герпес-вирусном гастрите.
Известно, что при нарушениях иммунного статуса герпетическая инфекция развивается чаще и характеризуется более тяжелым течением, что связано с недостаточностью иммунитета или избыточной иммунной реакцией. Механизмы иммунопатологии при хроническом гастрите, вызванном герпетической инфекцией, разнообразны и включают как ответ на персистирующий антиген, так и неадекватную регуляцию вирусспецифического иммунного ответа.
Изучение местного иммунитета при хроническом гастрите показало, что у пациентов пожилого и среднего возраста наблюдается снижение количества CD4-клеток, и увеличение количества CD8-клеток по сравнению со здоровыми людьми (р < 0,05).
Так, у пациентов пожилого возраста количество CD3-клеток составило 37,6 ± 0,5 %, у лиц среднего возраста этот показатель был равен 55,6 ± 1,9 % (p < 0,05). Отмечалась достоверная разница в содержании CD4-клеток у пожилых пациентов – 17,9 ± 0,2 %; у лиц среднего возраста их количество составило 35,3 ± 2,7 % (p < 0,05). При исследовании количества CD8-клеток показатели у пожилых пациентов были 26,3 ± 0,6 %, у лиц среднего возраста – 28,3 ± 0,9 %. Повышение показателя по сравнению со здоровыми было связано с затяжным течением заболевания или осложнениями.
Одновременно с этим отмечено снижение CD-56, CD-16, CD-15, CD-21 иммуноположительных клеток в обеих возрастных группах по сравнению с контрольной группой.
Так, содержание CD-56 клеток в основной группе было 25,8 ± 1,2 %; в контрольной группе – 34,5 ± 0,6 %. Содержание CD-16 клеток у пациентов основной группы составило 11,3 ± 0,6 %; у лиц среднего возраста – 13,4 ± 0,3 % (p < 0,05).
Определение CD-15 клеток выявило следующие показатели: в основной группе – 11,0 ± 0,3 %; в контрольной группе – 12,0 ± 0,24 % (p < 0,05). При этом содержание CD-21 клеток в основной и контрольной группе также выявило достоверную разницу: 14,2 ± 0,5 и 15,9 ± 0,06 % соответственно (p < 0,05).
Различия в иммунологических показателях у больных зависели от возраста пациентов. Установлено достоверное (p < 0,05) уменьшение количества данных показателей в группах пациентов пожилого возраста по сравнению с лицами среднего возраста (табл. 1).
Таким образом, отмечается достоверное снижение клеточного иммунитета при герпетическом инфицировании и развитии хронического гастрита у лиц пожилого возраста по сравнению с лицами среднего возраста (р < 0,05).
Выраженность иммунопатологического компонента в данном случае, по-видимому, можно снизить путем воздействия на отдельные звенья иммунной системы.
Таблица 1
Показатели местного иммунитета у больных разных возрастов при хроническом герпесвирусном гастрите
|
Показатели иммунитета, % клеток |
Основная группа (n = 200) |
Контрольная группа (n = 96) |
Здоровые лица (n = 120) |
|
CD-3 |
37,6^±^0,5 |
55,6^±^1,9* |
62,25^±^0,12 ** |
|
CD-4 |
17,9^±^0,2 |
35,3^±^2,7* |
34,75^±^0,16** |
|
CD-8 |
26,3^±^0,6 |
28,3^±^0,9* |
25,0^±^0,14** |
|
CD-56 |
25,8^±^1,2 |
34,5^±^0,6* |
36,0^±^0,11** |
|
CD-16 |
11,3^±^0,6 |
13,4^±^0,3* |
14,75^±^0,14** |
|
CD-15 |
11,0^±^0,3 |
12,0^±^0,24* |
14,75^±^0,14** |
|
CD-21 |
14,2^±^0,5 |
15,9^±^0,06* |
20,0^±^0,21** |
Примечание:
* (р < 0,05) – достоверность различий между показателями иммунитета в разных возрастных группах;
** (р < 0,01) –достоверность различий средних показателей у больных и здоровых.
Влияние инфицированности герпетическими вирусами на апоптоз в слизистой оболочке желудка.
Было изучено состояние клеточного гомеостаза у лиц с хроническим гастритом при инфицировании герпесвирусами. Сравнительный анализ проводился между практически здоровыми пациентами, у которых при фиброгастродуоденоскопии (ФГДС) и морфологическом исследовании
биоптатов, взятых из антрального и фундального отделов желудка, не обнаруживалось никаких воспалительных или атрофических изменений. При иммуногистохимическом исследовании эпителиоциты слизистой оболочки желудка показали низкую пролиферативную активность, определяемую по экспрессии маркера Ki-67 (количество иммунопозитивных по Ki-67 клеток = 1,46 ± 0,01) и индексу апоптоза (IАПТ = 0,33 ± 0,01 %). Наряду с этим наблюдалась очень низкая экспрессия антиапоптозного маркера (количество иммунопозитивных по Bcl-2 клеток = 0,93 ± 0,26 %).
У больных с хроническим гастритом при ФГДС определялся антральный гастрит. При морфологическом исследовании обнаруживались признаки активного воспаления, присущего герпес-вирусному гастриту.
Изучаемые показатели клеточного гомеостаза при хроническом гастрите характеризовались увеличением пролиферативной активности, выраженной через увеличение числа клеток, иммунопозитивных к Ki-67, до 12,70 ± 0,29 на 1 мм2 слизистой оболочки желудка и повышение IАПТ до 0,55 ± 0,02 % при умеренном возрастании экспрессии Bcl-2 (количество Bcl-2 иммунопозитивных клеток = 1,95 ± 0,12). У пациентов с хроническим гастритом при ФГДС выявлялась мультифокальная атрофия слизистой оболочки антрального отдела желудка.
При морфологическом исследовании на большом протяжении слизистой оболочки отмечалась ее гипертрофия с участками атрофии. В эпителиоцитах регистрировались дистрофические изменения различной степени выраженности. Возрастала численность слизеобразующих клеток. Границы между эпителиальными клетками плохо контурировали.
Помимо атрофии слизистой оболочки желудка наблюдались ее воспалительные изменения. При этом определялись отечность собственного слоя слизистой оболочки желудка, его инфильтрация лимфоцитами и плазматическими клетками. Исследуемые показатели клеточного гомеостаза характеризовались значительным преобладанием пролиферативной активности эпителиоцитов слизистой оболочки антрального отдела желудка (количество Ki-67 иммунопозитивных клеток = 68,70 ± 1,38) над их апоптозным потенциалом (IАПТ = 0,54 ± 0,02) при высокой экспрессии Bcl-2 (количество Bcl-2 иммунопозитивных клеток = 17,52 ± 0,98).
При исследовании процессов клеточного обновления (Ki-67, Bcl-2, IАПТ) определены следующие показатели. Для Ki-67 – 56,30 ± 0,99 клеток на 1мм2 слизистой оболочки желудка, для Bcl-2 – 7,75 ± 0,20 клеток и для IАПТ значение 1,92 ± 0,04 %, свидетельствующие о значительном возрастании пролиферативного потенциала эпителиоцитов слизистой оболочки желудка при умеренном увеличе-нии IАПТ.
Таким образом, данные изменения клеточного обновления слизистой оболочки желудка обусловлены повышением уровня экспрессии антиапоптозной молекулы Bcl-2.
Заключение
В ходе исследования выявлены особенности изменений местного иммунитета при хроническом гастрите герпесвирусной этиологии. Эти изменения характеризуются снижением содержания основных клеток иммунной защиты (CD-4, CD-8, CD-15, CD-16, CD-21, CD-56) и достоверным повышением уровня экспрессии антиапоптозной молекулы Bcl-2. Исходя из этого, таргетный подход к диагностике в гериатрии диктует необходимость этиотропной диагностики хронических гастритов в пожилом возрасте. Включение этиотропной диагностики хронического гастрита с применением методов этиологической диагностики, а также анализ местного иммунитета в диагностических программах в перспективе позволит улучшить этиопатогенетическую диагностику хронических гастритов в пожилом возрасте и соответственно оптимизировать их этиотропную и патогенетическую терапию с потенциальным включением антивирусных и иммуномодулирующих средств, а также качество диспансерного наблюдения. Таким образом, таргетный подход к диагностике и терапии в гериатрии является полезным и перспективным.
Рецензенты:
Осипова О.А., д.м.н., кафедра госпитальной терапии НИУ «БелГУ», г. Белгород;
Прощаев К.И., д.м.н., профессор, директор АНО «НИМЦ «Геронтология», г. Москва.
Работа поступила в редакцию 14.08.2014.
Библиографическая ссылка
Полев В.А., Крулевский В.А., Кветной И.М., Горелик С.Г., Горелик С.Г. ПЕРСПЕКТИВЫ ТАРГЕТНОГО ПОДХОДА К ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ В ГЕРИАТРИИ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10-1. – С. 131-135;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35228 (дата обращения: 23.11.2024).