На современном этапе уделяется большое внимание изучению закономерностей осуществления процессов жизнедеятельности различных организмов во времени. Существование эндогенных циркадианных ритмов, наряду со стабильно выявляемыми ультрадианными циклическими процессами на всех уровнях организации эукариот, не вызывает сомнений. Исследования физиологических и онтогенетических процессов бактериальных клеток в масштабах физического времени, проведенные с целью обнаружения «биологических часов», отличаются разнообразием и разноречивостью выводов [4, 9, 11].
Бактериальная популяция рассматривается как морфологически и физиологически непрерывно изменяющаяся и саморегулирующаяся многоклеточная система, обладающая высоким приспособительным потенциалом, направленным на сохранение вида [2] и занимающая свой специфический пространственно-временной континуум. С этой точки зрения хронобиологический подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методический прием [3].
Цель исследования – изучить особенности биологических свойств S. aureus в разное время суток.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служили музейные штаммы: S. aureus АТСС № 25923 и S. aureus № 209-Р (НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича). В качестве госпитальных вариантов использовали изоляты, выделенные из клинического материала раневого отделяемого пациентов ожогового центра Областной клинической больницы г. Тюмени (S. aureus № 2888; № 2891; № 2305).
Выделение и идентификацию госпитальных штаммов S. aureus проводили в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85. Биоритмы пролиферативной активности микроорганизмов изучали по разработанной авторами методике проведения биоритмологического эксперимента и обработке данных, учитывающих особенности работы с микроорганизмами [7, 8]. Гемолитическую активность определяли по методике Бухарина О.В. [1].
Хронодизайн исследований подразумевал получение по каждой оцениваемой функции 8-ми измерений в сутки с 3–5-кратным повторением условий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности p < 0,05 [10]. Поиск достоверных ритмов проведен линейно по периоду с шагом поиска 1 час в спектральном диапазоне 8–24 ч, где было выявлено три основных спектральных компонента с периодами Т = 8, Т = 12 и Т = 24 часа. Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с Т = 8, Т = 12 и Т = 24 часа: МЕЗОР (M) – среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (A) – расстояние от экстремума до МЕЗОРа и акрофаза(f) – момент времени ожидаемого экстремума функции.
Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов проводили с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2003. Достоверность различия сравниваемых выборок определяли непараметрическим методом статистической обработки: критерий Манна – Уитни (Т) – для несвязанных выборок (опыт-контроль, музейные и госпитальные культуры). Анализируемые различия считали достоверными при р < 0,05. Для установления связи между параметрами использовали корреляционный анализ по Спирмену (метод ранговой корреляции).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследований выявили суточную динамику пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus (табл. 1).
Таблица 1
Ритмометрические показатели пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus
Номер штамма |
Вклад ритма, % |
Мезор (M ± m), КОЕ/мл |
Амплитуда, КОЕ/мл |
Акрофаза |
24-часовой 12-часовой |
24-часовой 12-часовой |
24-часовой 12-часовой |
||
АТСС 25923 |
56,1* 10,4 |
204,4 ± 3,8 |
39,8 ± 5,9 16,9 ± 3,4 |
22 ч 21 мин 05 ч 45 мин |
209-Р |
38,4* 8,0 |
193,4 ± 4,3 |
37,8 ± 7,9 16,8 ± 9,7 |
22 ч 12 мин 10 ч 27 мин |
2888 |
6,7 15,4 |
157,6 ± 2,9 |
27,0 ± 17,2 41,8 ± 16,4 |
21 ч 33 мин 01 ч 33 мин |
2891 |
13,4 17,8* |
172,2 ± 2,9 |
22,6 ± 9,7 25,4 ± 8,9 |
23 ч 18 мин 08 ч 09 мин |
2305 |
10,9 44,0* |
187,2 ± 3,5 |
20,5 ± 5,2 31,4 ± 3,9 |
05 ч 51 мин 09 ч 16 мин |
Примечание. * – ритм достоверен (p < 0,05).
Биоритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов S. aureus были гетерогенны. Каждый из изолятов S. aureus 2305, 2888 и 2891 имел свой индивидуальный профиль ритма (рис. 1). Для S. aureus 2888 достоверным являлся период, близкий к 8-часовому – 74,6 % (р < 0,05). Выявление ультрадианного ритма с различными гармониками (12- и 8-часовые периоды) в хронобиологических исследованиях предполагает проявление нескольких акрофаз в течение суток. По всей видимости, ультрадианные ритмы, как ритмы с высокочастотными гармониками, для госпитальных изолятов имеют важное биологическое значение, так как определяют устойчивость к внешним воздействиям и способность к адаптивному ответу на периодические раздражители.
Рис. 1. Суточная динамика пролиферативной активности госпитальных изолятов S. aureus. Примечание: по оси абсцисс – время суток, часы; по оси ординат – количество колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл)
У музейных штаммов S. aureus 25923 и 209-Р ведущий – циркадианный (околосуточный) ритм пролиферативной активности (р < 0,05). Максимальные значения показателя наблюдались в вечернее и ночное время для обоих штаммов, минимальные – в утренние часы (рис. 2). Преобладание тех или иных гармоник в хроноинфраструктуре явно выражено и, можно сказать, является типовым признаком изученных временных рядов пролиферативной активности данных штаммов. Достоверные отличия показателей вкладов ритмов в спектральном составе, амплитуды и акрофазы ритмов музейных штаммов от ритмометрических показателей госпитальных изолятов S. aureus могут быть использованы для их дифференциации.
Рис. 2. Суточная динамика пролиферативной активности музейных штаммов S. aureus. Примечание: по оси абсцисс – время суток, часы; по оси ординат – количество колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл)
Исследования гемолитической активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus в разное время суток позволили выявить динамику данного фактора патогенности у изучаемых микроорганизмов в течение суток. Сравнительная характеристика ритмометрических показателей гемолитической активности представлена в табл. 2.
Таблица 2
Ритмометрические показатели гемолитической активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus
Номер штамма |
Вклад ритма, % |
Мезор (M ± m), % |
Амплитуда, % |
Акрофаза |
24-часовой 12-часовой |
24-часовой 12-часовой |
24-часовой 12-часовой |
||
АТСС 25923 |
63,0* 30,7* |
14,7 ± 0,1 |
5,0 ± 0,9 3,8 ± 3,8 |
22 ч46 мин 01 ч 13 мин |
209-Р |
72,1* 16,4 |
22,4 ± 0,1 |
4,8 ± 0,7 1,4 ± 1,2 |
17 ч35 мин 06 ч 55 мин |
2888 |
31,9* 19,9* |
4,7 ± 0,6 |
2,7 ± 0,9 2,1 ± 0,9 |
03 ч8 мин 02 ч 42 мин |
Примечание. * р < 0,05 – достоверные вклады ритмов.
Гемолитическая активность музейного штамма S. aureus 25923 характеризовалась достоверным циркадианным ритмом и достигала максимума в 23.00, минимума – в раннее утреннее время – с 5.00 до 8.00 часов (рис. 3). У музейного штамма S. aureus 209-Р прослеживался достоверный циркадианный ритм с акрофазой в 17.00 часов (максимальные значения показателя – 30,6 ± 0,2 %).
Среднесуточный показатель гемолитической активности у музейных штаммов S. aureus был достоверно выше, в сравнении с госпитальным изолятом, (Т = 40, р < 0,05 для штаммов 25923 и 2888; Т = 36, р < 0,05 для штаммов 209 и 2888). Высокая амплитуда (как показатель стабильности ритма) также отмечалась у музейных штаммов S. aureus.
Рис. 3. Суточная динамика гемолитической активности S. aureus. Примечание. По оси абсцисс – время суток, часы; по оси ординат – гемолитическая активность, %
Госпитальный изолят S. aureus 2888 был типирован как негемолитический, однако, исследуя этот показатель в суточной динамике, мы установили, что у данного микроорганизма определялось наличие гемолизинов, причем в большей степени в ночное время – 02.00 часа (11,1 ± 0,1 %). В утреннее и дневное время показатели гемолитической активности у госпитального изолята были настолько низкими (минимальные значения – 0,9 ± 0,03 %, 1,4 ± 0,1 %), что не могли быть определены традиционными методами (рис. 3).
Проведенный корреляционный анализ пролиферативной и гемолитической активности S. aureus показал положительную корреляцию между этими показателями у музейных штаммов (штамм 25923: r = 0,36; p < 0,05; штамм 209-Р: r = 0,29; p < 0,05).
Таким образом, в результате исследований было выявлено наибольшее сходство между музейными штаммами S. aureus по пролиферативной и гемолитической активности. Для музейных штаммов выявлены преимущественно циркадианные ритмы изучаемых показателей. Для госпитальных изолятов микроорганизмов характерна гетерогенность биоритмов пролиферативной активности, сформировавшаяся, вероятно, под влиянием окружающей среды. Госпитальные изоляты S. aureus имели различный спектральный состав ритмов, не совпадающий с ритмами музейных штаммов. У госпитального изолята S. aureus, типированного как негемолитический вариант, выявлены циркадианные и ультрадианные ритмы с акрофазой в ночное время.
При сравнении суточной динамики пролиферативной и гемолитической активности изучаемых штаммов отметили, что с увеличением пролиферативной активности наблюдалась максимальная продукция гемолизинов. У госпитальных изолятов не было выявлено четкой закономерности, хотя можно отметить, что в период минимальной пролиферативной активности наблюдался максимум активности гемолизинов.
Полученные данные могут свидетельствовать о различных суточных периодах физиологической активности микробных культур. Результаты исследований не противоречат существующему принципу попеременной (асинхронной) работы структур организма. Он справедлив для всего диапазона структурных уровней организма, начиная от системного и кончая молекулярным. Так, при интенсивном функционировании той или иной системы органов функциональная активность многих других систем снижается: в одной и той же клетке адаптивная интенсификация синтеза одних ферментов обязательно сопровождается ингибированием продукции других. Это свидетельствует о том, что организму свойственна способность экономии материальных ресурсов и максимальная концентрация их на главном участке развертывания приспособительной реакции в каждый данный момент [5, 6].
Выводы
1. Выявлены циркадианные ритмы пролиферативной и гемолитической активности у музейных штаммов и ультрадианные ритмы у госпитальных изолятов S. aureus, что имеет важное значение для адаптации патогена к меняющимся условиям внешней среды.
2. Хронобиологический подход позволил выявить генетически детерминированный признак – гемолитическую активность госпитального изолята S. aureus, типированного традиционным методом как гемолитически негативный вариант.
3. Установлена прямая корреляция между пролиферативной и гемолитической активностью музейных штаммов S. aureus и обратная корреляция у госпитального изолята.
4. Выявление суточной динамики биологических свойств определяет возможность нового подхода к изучению адаптивного потенциала микроорганизмов.
Рецензенты:
Ральченко И.В., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой фармацевтической технологии и фармакогнозии с курсом ботаники, ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России, г. Тюмень;
Жданова Е.В., д.м.н., доцент, заведующая кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России, г. Тюмень.
Работа поступила в редакцию 15.07.2014.
Библиографическая ссылка
Тимохина Т.Х., Губин Д.Г., Паромова Я.И., Николенко М.В. ХРОНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 7-5. – С. 1029-1033;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=34823 (дата обращения: 17.08.2024).