Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

ГЛЮКОКОРТИКОИДНАЯ ФУНКЦИЯ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫС СО СТРЕПТОЗОТОЦИНОВЫМ ДИАБЕТОМ В ДИНАМИКЕ ПРИЕМА МИФЕПРИСТОНА PER OS

Пальчикова Н.А. 1 Кузнецова Н.В. 1 Селятицкая В.Г. 1
1 ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН
Проведено исследование влияния длительного введения per os блокатора глюкокортикоидных рецепторов – мифепристона (МФ) ‒ на глюкокортикоидную функцию коры надпочечников здоровых крыс и крыс со стрептозотоциновым диабетом. У здоровых крыс в ответ на введение МФ отмечена выраженная реакция со стороны коры надпочечников, что проявилось их гипертрофией, усилением синтеза кортикостероидов на ранних этапах стероидогенеза, повышением содержания кортикостерона в сыворотке крови и увеличением экскреции неметаболизированного кортикостерона с мочой. При этом реакция со стороны надпочечников развивалась постепенно, достигая своего максимума после 5-–6 введений препарата. У крыс после введения стрептозотоцина на фоне сопутствующей стрептозотоциновому диабету резко выраженной активации глюкокортикоидной функции надпочечников в ответ на введение МФ дополнительных изменений величин исследованных показателей, характеризующих глюкокортикоидную функцию коры надпочечников, не обнаружено.
стрептозотоциновый диабет
надпочечники
кортикостерон
экскреция с мочой свободного кортикостерона
мифепристон
1. Функциональное состояние гипофизарно-надпочечниковой системы у юношей и молодых мужчин с артериальной гипертензией / К.К. Кубачева, Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, П.А. Сильницкий // Артериальная гипертензия. – 2009. –Т.15, № 3. – С. 320–324.
2. Armario A. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis: what can it tell us about stressors? / A. Armario // CNS Neurol Disord Drug Targets. – 2006. – Vol. 5, № 5. – P. 485–501.
3. Reduced expression of IL-3 mediates intestinal mast cell depletion in diabetic rats: role of insulin and glucocorticoid hormones / V. de F. Carvalho, Ede O. Barreto, F.A. Farias-Filho, L.H. Gomes, L.de L. Mendonça, R.S. Cordeiro, M.A. Martins, e Silva P.M. Rodrigues // Int. J. Exp. Pathol. – 2009. – Vol. 90, № 2. – P. 148–155.
4. Castelhano-Carlos M.J. The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats / M.J. Castelhano-Carlos, V. Baumans // Lab Anim. –2009. – Vol. 43, № 4. – P. 311–327.
5. Diabetes and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis / O. Chan, K. Inouye, M.C. Riddell, M. Vranic, S.G. Matthews // Minerva Endocrinol. – 2003. – Vol. 28, № 2. – P. 87–102.
6. Mifepristone reduces insulin resistance in patient volunteers with adrenal incidentalomas that secrete low levels of cortisol: a pilot study / M. Debono, R. Chadarevian, R. Eastell, R.J. Ross, J. Newell-Price // PLoS One. – 2013. – Vol. 8, № 4. – P. e60984.
7. Feelders R.A. Medical Treatment of Cushing’s Disease / R.A. Feelders, L.J. Hofland // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2013. – Vol. 98, № 2. – P. 425–438.
8. A new therapeutic approach in the medical treatment of Cushing’s syndrome: glucocorticoid receptor blockade with mifepristone / M. Fleseriu, M.E. Molitch, C. Gross, D.E. Schteingart, T.B. 3rd Vaughan, B.M. Biller // Endocr Pract. – 2013. – Vol. 19, № 2. – P. 313–326.
9. Fleseriu M. Medical management of Cushing’s disease: what is the future? / M. Fleseriu, S. Petersenn // Pituitary. – 2012. – Vol. 15, № 3. – P. 330–341.
10. Hepatic glucocorticoid receptor antagonism is sufficient to reduce elevated hepatic glucose output and improve glucose control in animal models of type 2 diabetes / P.B. Jacobson, T.W. von Geldern, L. Ohman, M. Osterland, J. Wang, B. Zinker, D. Wilcox, P.T. Nguyen, A. Mika, S. Fung, T. Fey, A. Goos-Nilsson, M. Grynfarb, T. Barkhem, K. Marsh, D.W. Beno, B. Nga-Nguyen, P.R. Kym, J.T. Link, N. Tu, D.S. Edgerton, A. Cherrington, S. Efendic, B.C. Lane, T.J. Opgenorth // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2005. – Vol. 314, № 1. – P. 191–200.
11. Johanssen S. Mifepristone (RU 486) in Cushing’s syndrome / S. Johanssen, B. Allolio // Eur. J. Endocrinol. – 2007. – Vol. 157, № 5. – P. 561–569.
12. Functional state of adrenocortical system in rats with manifest alloxan-induced diabetes mellitus / V.G. Selyatitskaya, O.P. Cherkasova, T.V. Pankina, N.A. Palchikova // Bull. Exp. Biol. Med. – 2008. – Vol.146, № 6. – P. 708–710.
13. Effect of mifepristone on glucocorticoid receptor gene expression in liver of streptozotocin-diabetic rats / V.G. Selyatitskaya, N.A. Palchikova, Yu.E. Gerbek, N.V. Kuznetsova // Bull. Exp. Biol. Med. – 2013. – Vol. 156, № 2. – P. 177–180.
14. Selyatitskaya V.G. Adrenocortical system activity in alloxan-resistant and alloxan-susceptible Wistar rats / V.G. Selyatitskaya, N.A. Palchikova, N.V. Kuznetsova // J. Diabetes Mellitus. – 2012. – Vol. 2, № 2. – P. 165–169.
15. Effect of RU486 on hepatic and adipocyte gene expression improves diabetes control in obesity-type 2 diabetes / A.L. Taylor, N. Frizzell, A.M. McKillop, P.R. Flatt, V.A. Gault // Horm. Metab. Res. – 2009. – Vol. 41, № 12. – P. 899–904.

Стероидный препарат мифепристон (МФ) обладает высоким сродством к рецепторам прогестерона и глюкокортикоидных гормонов, в силу чего он выступает как конкурентный антагонист этих гормонов, модифицируя их эффекты на уровне тканей-мишеней [11]. Использование МФ в схемах лечения болезни Кушинга и прогестеронзависимых заболеваний способствует улучшению у пациентов гликемического контроля, нормализует артериальное давление, вызывает потерю массы тела и снижение окружности талии, уменьшает депрессию и улучшает общее самочувствие [7, 8, 9]. Лечение больных с бессимптомной опухолью надпочечников МФ привело к снижению у них инсулинорезистентности [6]. Клинические наблюдения согласуются с результатами экспериментальных исследований. Так, введение МФ приводило к снижению концентрации глюкозы в крови натощак и после глюкозной нагрузки, а также уменьшению содержания мРНК ключевых ферментов глюконеогенеза в печени тучных мышей с сахарным диабетом 2 типа [15].

С другой стороны, прием МФ может стимулировать повышение уровня циркулирующих глюкокортикоидных гормонов из-за нарушения регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГАКС) по механизмам обратной связи, но при этом вызывать и симптоматическую надпочечниковую недостаточность, гипокалиемию и другие побочные эффекты [8, 10]. Такая активация синтеза глюкокортикоидных гормонов в коре надпочечников пациентов с болезнью Кушинга на фоне приема МФ снижает его эффективность как блокатора глюкокортикоидных рецепторов и ограничивает терапевтическую ценность препарата [11].

Все вышесказанное указывает на необходимость проведения детальных исследований механизмов влияния МФ на функциональную активность ГГАКС, подразумевая при этом как синтез кортикостероидных гормонов в надпочечниках, так и их эффекты в тканях-мишенях в условиях здорового и патологически измененного организма.

В работе проведено сравнительное исследование влияния длительного приема per os МФ на глюкокортикоидную функцию коры надпочечников здоровых крыс и животных со стрептозотоциновым диабетом.

Материал и методы исследования

Эксперименты проводили на половозрелых крысах-самцах породы Вистар (n = 20) с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации.

Животных содержали в одиночных клетках на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде. Стрептозотоциновый диабет у крыс моделировали однократным внутрибрюшинным введением раствора стрептозотоцина (SIGMA) в 0,85 % водном растворе NaCl в дозе 50 мг/кг массы тела после 12-часового голодания. Через 12 суток после введения стрептозотоцина крыс использовали в эксперименте с МФ. Использовали применяемый в акушерской практике таблетированный препарат «Мифепристон» (МИР-ФАРМ ЗАО Россия), предназначенный для перорального введения. Таблетки, содержащие по 200 мг МФ, растирали и готовили суспензию из расчета 20 мг МФ в 1 мл воды.

Были сформированы 5 групп животных: 1-я группа – интактные крысы; 2-я группа – крысам в течение 13 дней ежедневно в утреннее время (10‒11 часов) дозатором вводили per os по 0,25 мл воды; 3-я группа – крысам аналогично вводили per os суспензию МФ из расчета 20 мг/кг массы тела [3]; 4-я группа – крысам со стрептозотоциновым диабетом вводили per os воду; 5-я группа – крысам со стрепотозотоциновым диабетом вводили per os суспензию МФ. Для оценки суточной экскреции неметаболизированного кортикостерона индивидуально у каждой крысы проводили сбор мочи с использованием мочесборников в течение всего периода введения МФ. Животных выводили из эксперимента на следующие сутки после последнего введения МФ также в утреннее время (10–11 часов). В сыворотке крови определяли концентрацию глюкозы с использованием диагностического набора BioCon (Германия) для подтверждения наличия диабета.

В качестве основного показателя глюкокортикоидной функции надпочечников измеряли экскрецию неметаболизированного свободного кортикостерона с мочой [1], в качестве дополнительных показателей, также характеризующих функциональное состояние коры надпочечников, измеряли относительную массу надпочечников, концентрацию кортикостерона в сыворотке крови и содержание кортикостерона и прогестерона в гомогенатах надпочечников. После экстракции стероидов из биологического материала [14] определяли содержание кортикостерона радиоиммунным методом с использованием [1, 2, 6, 7-3H]-Corticosterone (Amersham) и Corticisterone antiserum (Sigma-Aldrich), прогестерона – иммуноферментным методом с использованием наборов Progesterone-ELISA kits (XEMA, Москва).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (Statsoft, США), для множественных сравнений применяли критерий Краскела ‒ Уоллиса, для парных сравнений – критерий Манна ‒ Уитни. Вероятность справедливости нулевой гипотезы принимали при 5 % уровне значимости. Данные в таблице представлены в виде M ± m, где M – выборочное среднее, m – стандартная ошибка.

Результаты исследования и их обсуждение

Содержание глюкозы в сыворотке крови крыс 4-й и 5-й групп через 12 дней после введения им стрептозотоцина составило 25,2 ± 1,7 ммоль/л, что было выше в четыре раза, чем у крыс 2-й и 3-й групп – 6,3 ± 0,2 ммоль/л, и указывало на сформированный стрептозотоциновый диабет с выраженной гипергликемией.

Экскреция кортикостерона с мочой у интактных крыс составила в среднем на всех сроках эксперимента 157,4 ± 96,3 пмоль/сутки. На рисунке представлены результаты измерения суточной экскреции кортикостерона в динамике эксперимента у крыс 2-й, 3-й (здоровые животные) и 4-й, 5-й (крысы со стрептозотоциновым диабетом) групп. У здоровых крыс в ответ на введение воды, что сопровождалось хэндлингом (взятием крыс в руки), величина суточной экскреции гормона имела тенденцию к повышению после 1–2 введения воды. Это закономерно, так как известно, что хэндлинг является мягким стрессорным воздействием и сопровождается повышением концентрации кортикостерона в крови [4]. В дальнейшем суточная экскреция кортикостерона у крыс 2-й группы не отличалась от величины соответствующего показателя у интактных крыс.

В ответ на введение МФ у крыс 3-й группы экскреция кортикостерона начинала повышаться, достигая максимума после 5–6 введения препарата. Затем началось постепенное снижение величины этого показателя, однако и в конце эксперимента (после 11–12 введений) она оставалась выше, чем у интактных и крыс 2-й группы. Полученные данные позволяют говорить о том, что у здоровых крыс в динамике введения МФ растет активность глюкокортикоидной функции надпочечников. Подобная реакция со стороны гормональной системы, как правило, сопровождается через определенное время ингибированием ее активности, несмотря на продолжение воздействий [2], что мы и отмечали по экскреции кортикостерона с мочой через 7–8 и больше введений МФ. Трудно сказать, на каком уровне – центральном или периферическом, организации ГГАКС в конкретной ситуации осуществляется подобное ингибирование, однако есть основания предполагать определенную роль в этом гипоталамических механизмов [2].

У крыс со стрептозотоциновым диабетом суточная экскреция кортикостерона более чем в 10 раз превышала величину показателя у здоровых крыс (см. рисунок, точка до введения). В ответ на 1–2 введение воды или МФ у крыс 4-й и 5-й групп экскреция кортикостерона снизилась, а, как мы уже обсуждали выше, у крыс 2-й группы – здоровых животных, повысилась. Полученные результаты свидетельствуют о формировании стойкой активации глюкокортикоидной функции надпочечников и нарушении стресс-реактивности у крыс с экспериментальным диабетом, что согласуется с результатами, полученными нами ранее [12, 14], а также со сведениями из научной литературы [5].

pic_52.wmf

Суточная экскреция кортикостерона с мочой у крыс в динамике эксперимента

В ответ на неоднократное введение воды или МФ отмечена тенденция к повышению величины экскреции кортикостерона у крыс как 4-й, так и 5-й групп. Однако если у крыс 4-й группы величина этого показателя оставалась до конца эксперимента на высоком уровне, то у крыс 5-й группы, аналогично крысам 3-й группы, наметилась слабая тенденция к снижению величины экскреции кортикостерона с мочой.

В таблице представлены результаты измерения содержания кортикостероидов в надпочечниках и кортикостерона в крови, что также характеризует глюкокортикоидную функцию надпочечников.

У здоровых крыс после многократного введения МФ повысилась относительная масса надпочечников, что соответствует результатам о повышении у них экскреции кортикостерона с мочой. У крыс со стрептозотоциновым диабетом величина этого показателя была еще выше, но введение МФ не оказало дополнительного влияния на массу надпочечников, что может быть связано с предшествующей выраженной гипертрофией этой железы, обусловленной введением стрептозотоцина.

У крыс 3-й группы после введения МФ содержание прогестерона в надпочечниках было повышено в два раза относительно величины этого показателя у животных 1-й группы (без введения препаратов) и 2-й группы (введение воды). Известно, что повышение содержания прогестерона в надпочечниках связано с усилением синтеза прегненолона на ранних этапах стероидогенеза, в этой связи можно предположить, что введение МФ не только способствует гипертрофии надпочечников, но и активирует активность процессов синтеза кортикостероидов на этапе образования прегненолона из холестерина. Содержание прогестерона в надпочечниках крыс после введения им воды или МФ на фоне стрептозотоцинового диабета (4-я и 5-я группы) было повышено относительно крыс 1-й группы, но не различалось между собой, что соответствует результатам измерения у них массы надпочечников (см. таблицу). Содержание в надпочечниках кортикостерона, аналогично содержанию прогестерона, было повышено у животных 3-й, 4-й и 5-й групп. Следовательно, у крыс со стрептозотоциновым диабетом дополнительной активации синтеза кортикостероидов в надпочечниках в ответ на введение МФ не происходило.

Относительная масса надпочечников, содержание прогестерона и кортикостерона в надпочечниках, концентрация кортикостерона в сыворотке крови (M ± m)

Показатель

Животные без диабета

Животные со стрептозотоциновым диабетом

р

Группа 1 – без введения препаратов

Группа 2 – введение воды

Группа 3 – введение МФ

Группа 4 – введение воды

Группа 5 – введение МФ

1

2

3

4

5

Относительная масса надпочечников, мг/100 г массы тела

13,9 ± 0,9

13,8 ± 0,6

18,4 ± 0,3

23,5 ± 1,6

23,7 ± 1,5

1,2–3 < 0,05

1,2,3–4,5 < 0,05

Содержание прогестерона в надпочечниках, пкмоль/мг ткани

2,28 ± 0,27

3,04 ± 0,65

5,57 ± 0,99

6,17 ± 1,04

6,18 ± 0,87

1,2–3,4,5 < 0,05

Содержание кортикостерона в надпочечниках, пкмоль/мг ткани

20,1 ± 2,2

21,5 ± 6,1

23,4 ± 2,2

23,9 ± 5,5

26,3 ± 4,8

 

Концентрация кортикостерона в сыворотке крови, нмоль/л

132,6 ± 55,2

238,3 ± 58,2

278,5 ± 31,9

339,3 ± 23,0

432,1 ± 78,2

1–3,4,5 < 0,05

Концентрация кортикостерона в сыворотке крови была повышена у животных 2-й группы относительно у крыс 1-й группы, но не достоверно; у крыс 3-й группы после введения МФ концентрация кортикостерона повышалась дополнительно относительно крыс 2-й группы и становилась достоверно выше, чем у животных 1-й группы. У крыс 4-й и 5-й групп со стрептозотоциновым диабетом концентрация кортикостерона была еще выше, чем у крыс 3-й группы, но не различалась между собой.

Таким образом, у здоровых крыс в ответ на введение им per os МФ отмечена выраженная реакция со стороны ГГАКС, что проявилось гипертрофией надпочечников, усилением синтеза кортикостероидов на ранних этапах стероидогенеза, повышением содержания кортикостерона в сыворотке крови и увеличением экскреции свободного кортикостерона с мочой. При этом следует отметить, что, судя по величине экскреции этого гормона с мочой, реакция со стороны ГГАКС на введение МФ развивалась постепенно, достигая своего максимума после 5–6 введений препарата. Затем ее выраженность начинала снижаться, но экскреция кортикостерона у крыс 3-й группы даже в конце эксперимента оставалась выше величины этого показателя у крыс 2-й группы (с введением воды) почти в три раза.

У крыс после введения стрептозотоцина на фоне сопутствующей стрептозотоциновому диабету резко выраженной активации ГГАКС [14] в ответ на введение МФ дополнительных существенных изменений величин исследованных показателей, характеризующих глюкокортикоидную функцию коры надпочечников, не было обнаружено.

Ранее нами было показано, что у крыс со стрептозотоциновым диабетом меньшему, чем у здоровых крыс повышению концентрации кортикостерона в ответ на трехкратное интраперитонеальное введение мифепристона соответствовало большее увеличение активности фермента тирозинаминотрансферазы в печени крыс. При этом количество мРНК гена глюкокортикоидного рецептора в печени крыс без диабета не изменялось после введения мифепристона, а в печени крыс со стрептозотоциновым диабетом – повышалось [13]. Сопоставление ранее полученных и приведенных в настоящей работе результатов затруднительно в связи с разными сроками и формами введения МФ. Однако общие выявленные закономерности позволяют высказать предположение, что у крыс со стрептозотоциновым диабетом реакция со стороны ГГАКС на введение МФ выражена в меньшей степени, чем у здоровых крыс, но этот феномен ассоциирован с более выраженной реакцией клеток-мишеней на глюкокортикоидные гормоны. Можно также предполагать, что реакция со стороны надпочечников может быть различна в разные сроки после начала введения МФ, что, однако же, требует проведения дальнейших исследований.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы» ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН.

Рецензенты:

Поляков Л.М., д.м.н., профессор, вр.и.о. директора, зав. лабораторией медицинских биотехнологий, ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, г. Новосибирск;

Лушникова Е.Л., д.б.н., профессор, зав. лабораторией цитологии и клеточной биологии, ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 15.05.2014.


Библиографическая ссылка

Пальчикова Н.А., Кузнецова Н.В., Селятицкая В.Г. ГЛЮКОКОРТИКОИДНАЯ ФУНКЦИЯ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫС СО СТРЕПТОЗОТОЦИНОВЫМ ДИАБЕТОМ В ДИНАМИКЕ ПРИЕМА МИФЕПРИСТОНА PER OS // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 8-1. – С. 100-104;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=34516 (дата обращения: 29.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074