Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

ВЛИЯНИЕ МОРФИНА НА СИНАПТИЧЕСКУЮ ПЛАСТИЧНОСТЬ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ ГИППОКАМПА

Береговой Н.А. 1 Панкова Т.М. 1 Сорокина Н.С. 1 Топчий Е.В. 1 Старостина М.В. 1
1 ФГБУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
В работе изучено влияние морфина на органотипическую культуру гиппокампа крыс. Показано, что длительное воздействие морфина не нарушает развития органотипической культуры гиппокампа и не влияет на жизнеспособность клеток. Острое и кратковременное (48 часов) воздействие морфина на культуру не изменяет базовых характеристик суммарных ВПСП мшистых волокон. В то же время достоверно увеличивается амплитуда суммарного ВПСП через 60 мин после тетанизации, то есть регистрируется фасилитация длительной посттетанической потенциации. Длительное (10 и более дней) культивирование в присутствии морфина вызывает достоверное увеличение амплитуды суммарного ВПСП мшистых волокон в ответ на тестовые стимулы и снижает вероятность формирования длительной посттетанической потенциации. В целом временная динамика изменений синаптической пластичности мшистых волокон в культуре гиппокампа аналогична таковой в срезах гиппокампа животных при развитии у них хронической опиатной зависимости. Полученные данные позволяют полагать, что органотипическая культура гиппокампа может быть использована как модель при изучении клеточно-молекулярных механизмов развития наркотической зависимости.
морфин
органотипическая культура гиппокампа
синаптическая пластичность
1. Береговой Н.А., Сорокина Н.С., Старостина М.В. Динамика изменений синаптической пластичности мшистых волокон в ходе формирования хронической зависимости от морфина // Бюллетень СО РАМН. – 2004. – Т. 113. – № 3. – С. 153–156.
2. Береговой Н.А., Панкова Т.М., Сорокина Н.С., Старостина М.В. Влияние моноклональных антител 5F5-В6 на синаптическую пластичность развивающегося и зрелого гиппокампа крыс // Бюлл. Сиб. отделения РАМН. – 1999. – № 1. – С. 76–79.
3. Ahlgren, H.; Henjum, K.; Ottersen, O.P.; Runden-Pran, E. Validation of organotypical hippocampal slice cultures as an ex vivo model of brain ischemia: Different roles of NMDA receptors in cell death signalling after exposure to NMDA or oxygen and glucose deprivation. Cell Tissue Res. – 2011. – № 345. – Р. 329–341.
4. Jin W., Chavkin C. Mu opioids enhance mossy fiber synaptic transmission indirectly by reducing GABA receptor activation B. Brain Research. 821. – 1999. – P. 286–293.
5. Harrison J.M., Allen R.G., Pellegrino M.J., Williams J.T., Manzoni O.J. Chronic Morphine Treatment Alters Endogenous Opioid Control of Hippocampal Mossy Fiber Synaptic Transmission // J Neurophysiol 87.– 2002. – Р. 2464–2470.
6. He S., Bausch S.B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis // Neuropharmacology. – 2014 Feb. – № 77. – Р. 379–86.
7. Holopainen I.E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity // Neurochem Res. – 2005. – № 30(12). – Р. 1521–8.
8. Hoppe J.B., Haag M., Whalley B.J., Salbego C.G., Cimarosti H. Curcumin protects organotypic hippocampal slice cultures from Aβ1-42-induced synaptic toxicity // Toxicol In Vitro. – 2013 Dec. – № 27(8). – Р. 2325–30.
9. Koyama R. The use of organotypic slice cultures for the study of epileptogenesis // Neuropathology–2013 Aug. – № 33(4). – Р. 475–9.
10. Nestler EJ. Cellular basis of memory for addiction // Dialogues Clin Neurosci. – 2013 Dec. – № 15(4). – Р. 431–43.
11. Noraberg J.1., Poulsen F.R., Blaabjerg M., Kristensen B.W., Bonde C., Montero M., Meyer M., Gramsbergen J.B., Zimmer J. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair // Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. – 2005 Aug. – № 4(4). – Р. 435–52.
12. Palyanova N.V., Pankova T.M., Starostina M.V., Kicha A.A., Ivanchina N.V., Stonik V.A. Neuritogenic and Neuroprotective Effects of Polar Steroids from the Far East Starfishes Patiria pectinifera and Distolasterias nipon // Mar. Drugs. – 2013. – № 11. – Р. 1440–1455.
13. Pu L., Guo-Bin Bao G.-B., Xu N.-J., Ma L., Pei G. Hippocampal Long-Term Potentiation Is Reduced by Chronic Opiate Treatment and Can Be Restored by Re-Exposure to Opiates // The Journal of Neuroscience, March 1. – 2002. – № 22(5). – Р. 1914–1921.
14. Skelding K.A., Arellano J.M., Powis D.A., Rostas J.A. Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke // J Vis Exp. – 2014 Feb. – № 4 (84).
15. Von der Goltz C., Kiefer F. Learning and memory in the aetiopathogenesis of addiction: future implications for therapy? // Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. – 2009. – Vol. 259. – Suppl. 2. – P. 183–187.

Широкое распространение наркомании делает актуальными исследования нейробиологических основ формирования наркотической зависимости и поиска новых методов и подходов к ее лечению. В настоящее время экспериментальные работы по изучению эффектов вызывающих зависимость препаратов проводятся как in vivo, на различных моделях аддикции на животных, так и in vitro, на первичных культурах нервных клеток и клеточных линиях.

Культуры, являющиеся относительно однородными клеточными популяциями, предоставляют широкие возможности для изучения молекулярных механизмов действия наркотических веществ и первичного скрининга протекторных соединений, но не позволяют исследовать функционирование нейронных ансамблей и влияние взаимодействий между различными типами клеток нервной системы. Эти ограничения могут быть преодолены использованием органотипических культур нервной ткани.

Особенностью органотипических культур нервной ткани, отличающей их от первичных культур нейронов и клеточных линий, является сохранение характерной для данного отдела мозга цитоархитектуры и внутренних межнейронных связей. Это позволяет в условиях in vitro исследовать клеточные и молекулярные механизмы патологических состояний, функциональные параметры синаптической пластичности, делает их удобной моделью для скрининга биологически активных соединений.

Наиболее широко используется органотипическая культура гиппокампа (ОКГ). Mорфологическое и функциональное становление системы внутренних связей гиппокампа происходит постнатально, срезы гиппокампа, взятые у животных в раннем постнатальном периоде, можно культивировать в течение длительного срока. При этом сохраняется расположение клеточных слоев, а формирование и функциональное созревание специфических синаптических связей происходит in vitro. Таким образом, культура гиппокампа представляет собой удобную модель для изучения морфологических и функциональных характеристик как развивающейся, так и зрелой нервной ткани. ОКГ были использованы для изучения эффектов гипоксии, гипогликемии, комбинации их при моделировании ишемии, окислительного стресса, повреждающего действия возбуждающих аминокислот, нейротоксинов, органических растворителей и этанола [3, 7, 11].

В представленной работе мы анализировали влияние кратковременного и длительного культивирования ОКГ с морфином и вызванных этим изменений синаптической пластичности, сопоставляя эти данные с ранее полученными на животных при формировании у них хронической опиатной зависимости [1].

Материалы и методы исследования

Культивирование: Крыс в возрасте 7–8 дней получали из Лаборатории экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН, все экспериментальные процедуры на животных были одобрены комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «НИИМББ» СО РАМН и проводились в соответствии с Принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 53434-2009) и согласно «Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях». Получение и культивирование срезов гиппокампа проводили, как описано ранее [12]. Коротко, поперечные срезы гиппокампа (400 мкм) помещали на покрытые коллагеном стекла, оставляли на 30 мин. во влажной камере (чашки Петри с «пьедесталами») при 36 °С в CO2-инкубаторе для прикрепления, а затем добавляли среду, содержащую 25 % раствора Хэнкса, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 65 % среды Игла в модификации Дульбекко и добавки инсулина (0,2–0,3 ед./мл), L-глутамина (0,29 г/л), глюкозы (6,5 мг/мл). Культивирование срезов вели в СО2-инкубаторе при 5 % СО2, 90 % влажности, 36 °С. Смену среды проводили раз в два дня. На второй день культивирования в среду на 24 часа добавляли антимитотические препараты (5-Fluoro-2-deoxyuridine, cytosine-b-d-arabinofuranoside, uridine, Sigma, США) в конечной концентрации 10–6–10–7 М для подавления размножения макрофагов и фибробластов, нарушающего органотипию среза.

Культивирование контрольных культур вели в стандартной культуральной среде. Для исследования длительного воздействия морфина (конечная концентрация 10 μМ) морфин добавляли к культуральной среде с 4-го дня культивирования, при изучении кратковременного (48 ч) воздействия морфин вносили на 10–11 дни in vitro. Состояние органотипических культур регулярно оценивали визуально.

Морфологический анализ и оценка выживания клеток. Для оценки морфологических характеристик использовали общепринятые методы гистологического анализа. На 5, 10, 14, 21 дни культивирования эксплантаты фиксировали 10 % нейтральным формалином и затем окрашивали крезиловым фиолетовым или импрегнировали серебром по методу Бодиана с последующим контрастированием хлорным золотом. Для оценки количества погибших клеток препараты окрашивали иодидом пропидия (3 µг/мл среды, 1 час в СО2-инкубаторе), промывали раствором Хэнкса, фиксировали 4 % параформом (1 ч) и заключали в глицерин. Анализ полученных препаратов проводили на конфокальном микроскопе LSM 510 (Carl Zeiss).

Электрофизиологические эксперименты. Для выявления функциональных изменений, вызванных острым и хроническим действием морфина, регистрировали суммарный возбуждающий постсинаптический потенциал (ВПСП) мшистых волокон в ответ на тестирующие стимулы и оценивали параметры синаптической пластичности на модели длительной посттетанической потенциации (ДПТП). Ранее было показано [2], что ДПТП может быть вызвана в ОКГ крыс начиная с 7–9 дней культивирования, поэтому для экспериментов использовали ОКГ с 13 по 20 день in vitro.

Для проведения электрофизиологических экспериментов стекла с ориентированными эксплантатами помещали в проточную термостатированную камеру в среду следующего состава (в мМ): NaCl – 124; KCL – 4,9; KH2PO4 – 1,2; MgSO4 – 1,3; CaCl2 – 2,5; NaHCO3 – 25,6; D-глюкоза – 10; pH 7,5, аэрируемую карбогеном (95 % О2 – 5 % CО2). После 20-минутной инкубации стимулирующий электролитически заточенный биполярный вольфрамовый электрод помещали в область мшистых волокон, регистрирующий стеклянный электрод (сопротивление 2–5 МОм, заполнен 2,5 М NaCl) – в зоне начальных апикальных дендритов пирамидных нейронов области СА3. Тестирование проводили при помощи одиночных прямоугольных стимулов длительностью 200 мкс, наносимых не реже, чем через 5 мин. Вызванные потенциалы регистрировали при помощи 12-разрядного АЦП (Digidata, Molecular Devices) и обрабатывали, используя пакет программ pClamp-6 (Axon Instruments). Для выработки ДПТП амплитуду тестирующего стимула подбирали таким образом, чтобы величина ответа составляла около 50 % от максимальной. Тетанизацию проводили тремя последовательными пачками стимулов частотой 200 Гц, длительность каждой пачки импульсов 1 с, интервал между пачками 2 с. Через 10 мин процедуру тетанизации повторяли.

Регистрацию вызванных потенциалов вели не менее 60 мин после тетанизации, что позволяло сделать заключение о формировании или отсутствии ДПТП. Считали, что ДПТП формируется, если после второй тетанизации амплитуда сигнала увеличивалась более чем в 1,5 раза (или на 50 %), и оставалась таковой на протяжении всего времени наблюдения. Относительное изменение амплитуды суммарного ВПСП после тетанизации вычисляли по формуле

beregov01.wmf,

где A0 – амплитуда ответа на тестовый стимул до тетанизации; At – соответствующая амплитуда после тетанизации.

Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 9 (StatSoft) и OriginPro 8.1 (OriginLab Corporation). Для оценки межгрупповых различий использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Оценку достоверности различий средних значений параметров проводили с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Манна ‒ Уитни. Различия между группами считались достоверными при уровне значимости p < 0,05. Данные представлены в виде арифметического среднего и стандартной ошибки среднего (M ± SEM).

Результаты исследования и их обсуждение

Через сутки после посадки срезов и в течение всего последующего срока культивирования в контрольной и опытной (культивирование в присутствии 10 µМ морфина) группах культур наблюдали формирование типичной зоны роста, образующейся по периферии эксплантата за счет мигрирующих астроцитов и фибробластов, а также покидающих эксплантат отростков нейронов. Незначительная их часть покидает эксплантат по всей его границе, в то время как наибольшая часть нейритов выходит из эксплантата в зоне фимбрии и остатка энторинальной коры, то есть в тех областях, где в норме проходят выходящие из гиппокампа аксоны пирамидных нейронов области СА3 и СА1. В этой зоне в ходе культивирования можно наблюдать фасцикуляцию (образование пучков) аксонов. Постепенно фибробласты мигрируют к границам зоны роста, а нейриты, тела и отростки астроцитов, контактируя, образуют плотную сетевидную структуру.

Нарушений прикрепления к субстрату в опытной и контрольных группах срезов отмечено не было. Расположение основных клеточных слоев (слой гранулярных клеток зубчатой фасции и слой пирамидных нейронов Аммонова рога) также соответствовало таковому в срезах гиппокампа целого мозга.

Как можно увидеть на рис. 1, единичные погибшие клетки как в контрольных, так и в опытных ОКГ расположены по всей толще эксплантата и не ассоциированы с каким-либо из определенных полей. В опытных культурах можно было отметить несколько более интенсивное окрашивание мелких ядер в области зубчатой фасции, где расположена герминальная зона, содержащая недиффенцированные клетки-предшественники.

pic_31.tifа pic_32.tifб

Рис. 1. Оценка жизнеспособности клеток в органотипической культуре гиппокампа с помощью окраски иодидом пропидия. 17 дней in vitro: а – культивирование в стандартной среде (контроль); б – культивирование в присутствии морфина (10 µМ). Длина волны возбуждения 535 нМ, излучения – 560 нМ

В ОКГ присутствуют крупные клетки-макрофаги, представляющие собой активированную микроглию. Активность их наиболее высока на ранних этапах культивирования, когда они участвуют в удалении материала, поврежденного при приготовлении срезов, а затем постепенно снижается. При использовании иодида пропидия клетки макрофагальной глии иногда захватывали окрашенный клеточный материал, в этом случае свечение было локализовано в цитоплазме, в то время как ядро оставалось темным. Мы не наблюдали достоверного изменения числа таких клеток в опытных ОКГ по сравнению с контрольными. Таким образом, длительное культивирование срезов гиппокампа крыс в среде, содержащей 10 µМ морфина, не влияло существенным образом на жизнеспособность клеток ОКГ.

Электрофизиология

Непосредственная аппликация морфина (10 µМ) на органотипическую культуру с последующей 20-минутной инкубацией не вызывает достоверных изменений амплитуды и латентности ВПСП мшистых волокон в ответ на тестовый стимул. В то же время под воздействием морфина амплитуда ВПСП через 60 мин после тетанизации достоверно выше, чем в контрольных культурах (рис. 2).

pic_33.tifа pic_34.tifб

Рис. 2. а – изменение относительной амплитуды суммарного ВПСП мшистых волокон через 60 минут после тетанизации при 20-минутной инкубации после аппликации морфина на ОКГ. * – р < 0,05 (n = 7); б – изменение относительной амплитуды суммарного ВПСП мшистых волокон через 60 минут после тетанизации при 48-часовом культивировании в присутствии 10 µМ морфина на ОКГ. * – р < 0,05 (n = 8)

Кратковременное (48 час) культивирование в присутствии морфина также не изменяло базовых характеристик и вызывало фасилитацию ДПТП мшистых волокон.

При длительном культивировании в присутствии морфина (10 и более дней) было зарегистрировано достоверное увеличение амплитуды суммарного ВПСП мшистых волокон в ответ на тестовые стимулы (контроль – 3,4 ± 0,36 мВ, n = 11; опыт – 4,9 ± 0,47 мВ, n = 9; p = 0,019). При этом вероятность формирования ДПТП при использовании стандартной процедуры тетанизации значительно уменьшалась: если в контрольных культурах формирование ДПТП наблюдали в 85 % случаев, то в опытных – менее чем в 40 %.

Моделирование различных заболеваний мозга, таких как инсульт [3, 14], болезнь Альцгеймера [8], эпилепсия [6, 9] in vitro, на органотипической культуре гиппокампа, не только расширяет возможности исследования клеточно-молекулярных механизмов этих заболеваний, но и позволяет проводить тестирование широкого спектра нейропротекторных соединений.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что долговременное культивирование в присутствии морфина не влияет на жизнеспособность ОКГ, но приводит к модификации функциональных характеристик системы синаптических связей «гранулярные клетки зубчатой фасции – пирамидные нейроны области СА3» (мшистых волокон).

Исследования последних лет показали, что развитие наркотической зависимости обусловлено изменениями нейрональной и синаптической пластичности различных отделов мозга, а молекулярные механизмы этих изменений подобны тем, что происходят при обучении и запоминании [10, 15]. Наибольшее количество работ было выполнено на гиппокампе, структуре, непосредственно связанной с процессами обучения и памяти, с использованием ДПТП как экспериментальной модели синаптической пластичности. Полученные данные о параметрах ДПТП в гиппокампе животных с хронической зависимостью от морфина противоречивы, на различных системах синаптических связей показаны как фасилитация ДПТП, так и нарушения ее формирования [5, 13]. Эти противоречия не могут быть объяснены только использованием разных схем получения морфина животными, но связаны, вероятно, со стадийностью развития хронической зависимости. Ранее мы исследовали динамику изменений ДПТП мшистых волокон в ходе развития, на ранних и поздних стадиях сформированной хронической опиатной зависимости [1], что дает возможность сопоставления с данными, полученными в представленной работе. Так, аппликация морфина на нативную культуру вызывает фасилитацию ДПТП мшистых волокон, что согласуется с результатами, полученными на срезах гиппокампа нативных животных [4]. Кратковременная (48 час) инкубация ОКГ с морфином соответствует периоду развития и ранним стадиям зависимости у животных, а длительная – более поздним стадиям (в наших экспериментах – после 50 дня потребления наркотика), когда выявляется нарушение формирования ДПТП [1]. Таким образом, временная динамика изменений синаптической пластичности при инкубации ОКГ с морфином в целом соответствует динамике изменений в гиппокампе животных при развитии хронической зависимости от морфина. Полученные данные позволяют предполагать, что ОКГ может быть использована в качестве модели для изучения клеточно-молекулярных процессов, лежащих в основе развития наркотической зависимости.

Рецензенты:

Ратушняк А.С., д.б.н., зав. лабораторией «Биомедицинская информатика», ФГБУН «Конструкторско-технологический институт вычислительной техники» Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск;

Гилинский М.А., д.б.н., зав. лабораторией регуляции адаптационных процессов, ФГБУН «Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 15.05.2014.


Библиографическая ссылка

Береговой Н.А., Панкова Т.М., Сорокина Н.С., Топчий Е.В., Старостина М.В. ВЛИЯНИЕ МОРФИНА НА СИНАПТИЧЕСКУЮ ПЛАСТИЧНОСТЬ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ ГИППОКАМПА // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 8-1. – С. 59-63;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=34508 (дата обращения: 29.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074