Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Ермолаева Е.Н. 1 Кривохижина Л.В. 1 Кантюков С.А. 1 Сурина-Марышева Е.Ф. 2

---

1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

2 ФГБОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры»

Тромбоциты человека, как в состоянии покоя, так и при АДФ-индуцированной активации, вырабатывают свободные радикалы, которые можно определить методом хемилюминесценции. Регистрация собственного свечения тромбоцитов в присутствии люминола позволяет оценивать исходное состояние тромбоцитов. Метод основан на добавлении в обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) люминола и регистрации хемилюминесценции. Добавление физиологического индуктора агрегации АДФ (аденозин дифосфата) в дозе, используемой для лабораторной оценки агрегации тромбоцитов, увеличивает АДФ-индуцированную активацию тромбоцитов и хемилюминесценцию более чем в 3 раза. АДФ-индуцированная хемилюминесценция тромбоцитов позволяет установить функциональное состояние тромбоцитов, оценивая их способность образовывать свободные радикалы в процессе активации клеток. АДФ-индуцированная активация тромбоцитов сопровождается активацией свободнорадикальных процессов с одновременной активацией антиокислительных систем.

Статья в формате PDF

314 KB

хемилюминесценция

свободнорадикальное окисление

тромбоциты

1. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. – 2009. – Т. 49. – С. 341–388.

2. Волчегорский И.А. Сопоставление различных подходов к определению продуктов ПОЛ в гептан – изопропанольных экстрактах крови / И.А. Волчегорский, А.Г. Налимов, Б.Г. Яровинский и др. // Вопр. мед. химии. – 1989. – Т. 35, № 1. – С. 127–131.

3. Коробейникова Э.Н. Модификация определения продуктов ПОЛ в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. – 1989. – № 7. – С. 8–10.

4. Кривохижина Л.В. Хемилюминесценция тромбоцитов. Использование метода хемилюминесценции для определения активности тромбоцитов / Л.В. Кривохижина, Е.Н. Ермолаева, С.А. Кантюков, Д.Н. Кривохижин // Вестн. Тюменского гос. ун-та. – 2013. – № 6. – С. 174–181.

5. Пат. 2230322 РФ Способ обнаружения свечения тромбоцитов / А.П. Исаев, Л.В. Кривохижина, С.А. Кантюков, Е.Н. Ермолаева, И.Н. Курилов. – М., 2004. – 5 с.

6. Спектор Е.Б. Определение общей антиокислительной активности плазмы крови и ликвора / Е.Б. Спектор, А.А. Ананенко, Л.Н. Политова // Лаб. дело. – 1984. – № 1. – С. 26–28.

7. Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. – СПб.: Изд-во СПбГМУ; 2000. – С. 226.

8. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. – Уфа: Изд-во БГМИ, 1995. – 90 с.

9. Krötz F, Sohn HY, Pohl U. Reactive oxygen species-players in the platelet game Arterioscler Thromb // Vasc Biol. – 2004. – T. 24. – P. 1988–1996.

10. Olas B, Wachowicz B. Resveratrol, a phenolic antioxidant with effects on blood platelet functions // Platelets. – 2005. – T. 16. – P. 251–260.

11. Panse M, Block HU, Forster W, Mest HJ. An improved malondialdehyde assay for estimation of thromboxane synthase activity in washed human blood platelets // Prostaglandins. – 1985. – T. 30. – P. 1031–1040.

12. Sobotková А., Mášová-Chrastinová L., Suttnar J. et all. Antioxidants change platelet responses to various stimulating events // Free Radic Biol Med. – 2009. – T.47 (12). – P. 1707–1714.

Активация тромбоцитов является следствием развития каскада сложных взаимосвязанных реакций, приводящих к изменению метаболизма кровяных пластинок и их ультраструктурной организации. Внутренние процессы активации завершаются осуществлением специфических тромбоцитарных функций – гемостатической, репаративной, защитной и других [7]. К механизмам активации тромбоцитов относятся: перестройка плазматической мембраны, мобилизация и движение ионов, гидролиз инозитольных фосфолипидов, высвобождение и окисление мембранной арахидоновой кислоты, изменение метаболизма циклических нуклеотидов и другие явления. Обнаружение систем ферментного синтеза активных форм кислорода в тромбоцитах позволяет предположить возможность их участия в активации кровяных пластинок. При активации тромбоцитов тромбином, аденозиндифосфатом (АДФ) – основными индукторами агрегации кровяных пластинок – происходит активация фосфолипазы А2, инициирующей метаболизм арахидоновой кислоты и производство малонового диальдегида. Активные формы кислорода являются новыми модуляторами тромбоцитарной активности. Показано, что их экзогенная или внутритромбоцитарная продукция влияет на тромбоцитарную функцию [12].

Цель исследования – определить интенсивность производства свободных радикалов в интактных и активированных тромбоцитах, используя метод хемилюминесценции.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на крови здоровых людей – доноров областной станции переливания крови (n = 75). Забор крови осуществлялся согласно правилам для гемостазиологических исследований. Кровь стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия (5:1). Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали центрифугированием цитратной крови при 200 g в течение 5 минут при комнатной температуре. Бедную тромбоцитами плазму (БТП) получали после отбора из пробирок ОТП и последующего центрифугирования при 650 g в течение 25 мин. Количество тромбоцитов в ОТП доводили до 300000 кл/мкл добавлением бедной тромбоцитами плазмы. В качестве опытной пробы брали ОТП, контролем служили пробы с БТП. АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали по методу Борна: определяли первую волну агрегации (на 2-й минуте), вторую волну (10-я минута) и завершение агрегации (30-я минута).

Исследование выполнено на приборе хемилюминометре ХЛ-003. Объем пробы составлял 5 мл, использовали медленное перемешивание, температурный режим – 37 °С, время регистрации 30 минут. Для усиления ХЛ добавляли 1 мл рабочего люминола. Люминол (м.в. 177) готовили на диметил сульфоксиде из расчета 10–4 и хранили в холодильнике. Рабочий раствор готовили из маточного раствора разведением на стерильном физиологическом растворе в 1000 раз (рН 7,0–7,2) [5]. Индуктором активации кровяных пластинок служил АДФ в конечной концентрации 6,4×10–7 М, в дозе, используемой для исследования агрегационной способности тромбоцитов.

Результаты считывались на компьютере и отображались графически (рисунок). При оценке интенсивности ХЛ учитывали светосумму свечения и максимальную светимость. О генерации активных форм кислорода судили по интенсивности базисной (без люминола), люминолзависимой и АДФ-индуцированной хемилюминесценции тромбоцитов (в присутствии люминола) [4]. На метод собственного свечения тромбоцитов получено авторское свидетельство [5].

Хемилюминесценция тромбоцитов: 1 – базисная хемилюминесценция (без люминола); 2 – люминолзависимое свечение тромбоцитов; 3 – АДФ-индуцированная хемилюминесценция тромбоцитов (в присутствии люминола)

Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли спектрофотометрическим методом в изопропанольной фракции [2]; уровень малонового диальдегида (МДА) определяли в цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой [3]; общую антиокислительную активность (ОАО) оценивали по степени подавления липопероксидации in vitro в присутствии суспензии мембран эритроцитов [6].

Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ Statistica 6, использован непараметрический критерий Манна ‒ Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Процессы свободнорадикального окисления, протекающие с образованием радикалов RО‒ и RO2‒, можно оценивать посредством измерения хемилюминесценции (ХЛ). Биохемилюминесцентный метод не выступает в качестве прямого количественного метода определения свободных радикалов, методом ХЛ непосредственно определяется не концентрация радикалов, а интенсивность и скорость реакции, в которой они образуются. Метод хемилюминесценции обладает тем преимуществом, что, во-первых, он обычно не связан с изменением хода процессов в растворах, клетках или даже целых тканях, где регистрируется свечение, а во-вторых, весьма чувствителен при обнаружении именно высокореакционных радикалов кислорода [8]. Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и получила название «сверхслабого свечения». Поэтому применяются специальные вещества, которые усиливают процессы хемилюминесценции. В качестве подобного усилителя применяется люминол – это соединение, вступающее в реакции с образовавшимися активными формами кислорода или органическими свободными радикалами [1].

На первом этапе исследования ставилась задача выявления базисного свечения интактных тромбоцитов. Сравнивая показатели базисной хемилюминесценции обогащенной и бедной тромбоцитами плазмы, достоверно значимых отличий не выявили. Показатели хемилюминесценции тромбоцитов: базисной (без люминола), люминолзависимой и АДФ-индуцированной хемилюминесценции тромбоцитов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Показатели хемилюминесценции тромбоцитов

Примечания: р1 – между базисной светимостью в ОТП и в БТП; р2 – между ОТП без люминола и с люминолом; р3 – между базисной светимостью с люминолом и АДФ-индуцированной хемилюминесценцией.

Добавление люминола в БТП не приводило к достоверно значимому повышению показателей ХЛ, но внесение люминола в ОТП увеличивало ХЛ тромбоцитов – максимальная светимость возрастала более чем в 16 раз, светосумма свечения более чем в 50 раз. Добавление АДФ в ОТП в дозе, используемой для исследования агрегационной способности тромбоцитов, приводило к активации процессов свободнорадикального окисления в кровяных пластинках: светосумма свечения возрастала в 3,2 раза, максимальная светимость – в 1,5 раза. Известно, что АДФ является физиологическим индуктором агрегации тромбоцитов, следовательно, процесс агрегации связан с активацией свободнорадикального окисления (СРО) в тромбоцитах. Следствием активации СРО в тромбоцитах может быть накопление вторичных (МДА) и конечных (Шиффовы основания) продуктов ПОЛ. Уровень ПОЛ в процессе АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов определяли на 2-й, 10-й минуте агрегации и на 30-й минуте агрегации, то есть после ее завершения (табл. 2).

Таблица 2

Содержание продуктов ПОЛ в ОТП в процессе АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов

Примечания: р – достоверность с ОТП (интактными); р1 – с ОТП (2 мин. агр.); р2 – достоверность с ОТП (10 мин. агр.).

В процессе агрегации на 2-й минуте в ОТП проявляется тенденция к возрастанию МДА и Шиффовых оснований, но при завершении процесса агрегации (30-я минута) вторичные и конечные продукты ПОЛ достоверно снижаются либо относительно начала агрегации, либо интактных тромбоцитов. Это может быть связано с постепенным повышением мощности общей антиокислительной активности (АОА) (табл. 3).

Таблица 3

Общая антиокислительная активность в ОТП в процессе АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов

Примечания: р – достоверность с ОТП (интактными); р1 – с ОТП (2 мин. агр.); р2 – достоверность с ОТП (10 мин. агр.).

Действительно, со 2-й минуты агрегации начинается постепенное повышение антиокислительной активности с достоверным ее повышением на 30-й минуте агрегации.

Наше исследование показало, что тромбоциты, как в состоянии покоя, так и при АДФ-индуцированной активации вырабатывают свободные радикалы, которые можно зарегистрировать методом хемилюминесценции. Активация тромбоцитов АДФ, следствием которой будет процесс агрегации, приводит к повышению образования свободных радикалов и увеличению хемилюминесценции тромбоцитов более чем в 3 раза. Внутриклеточная сигнализация, необходимая для реорганизации цитоскелета и гранулярной секреции, связана с активацией образования свободных радикалов и осуществляется через фосфоинозитидный путь, за счет метаболизма эйкозаноидов и т.д. Образование эйкозаноидов из арахидоновой кислоты катализируется ферментами циклооксигеназа 1 и 2 (ЦОГ1; ЦОГ2). ЦОГ1 вовлечена в тромбоцитарную функцию; ЦОГ2 преимущественно представлена при воспалении. Наличие в тромбоцитах микропероксисом, обеспечивающих эндогенный синтез пероксида водорода и его выделение в кровь в ходе реакции освобождения [7], указывает на важную роль АФК в регуляции агрегации-дезагрегации тромбоцитов. Предполагается, что активные метаболиты кислорода являются новыми модуляторами тромбоцитарной активности [9]. Показано, что их экзогенная или внутритромбоцитарная продукция влияет на тромбоцитарную функцию. Это реализуется различными АФК, включая O2–, HO – и H2O2, из тромбоцитарного происхождения, выходящих из тромбоцитов после их стимуляции коллагеном или тромбином. Активация пластинок коллагеном достаточно специфична особенно относительно гидроксильных радикалов и перекиси водорода. Более низкий уровень СРО в тромбоцитах был найден при активации АДФ и тромбином [12]. Активация тромбоцитов и вовлечение их в процесс адгезии и агрегации обусловлены трансформацией арахидоновой кислоты в простагландиновые эндопероксиды, которые тромбоксан-синтетазой превращаются в тромбоксан А2, малоновый диальдегид (МДА) и 12(L)-гидроксигептадека-5,8, 10-триеновая кислота в соотношении 1:1:1 [11]. На фоне возрастания ХЛ тромбоцитов мы не получили достоверно повышения МДА и Шиффовых оснований в процессе их агрегации. Прослеживалась лишь тенденция к возрастанию МДА и Шиффовых оснований на 2-й минуте агрегации, что соответствует первой волне агрегации, в конце агрегации (30 мин) эти метаболиты достоверно снижались относительно первой волны. На наш взгляд, это обусловлено постепенным возрастанием мощности антиокислительной системы, достигающих максимальных величин при завершении агрегации. В доступной нам литературе мы не нашли сведений об изменениях антиокислительной защиты тромбоцитов в процессе их агрегации. Известно, что на функцию тромбоцитов влияет состояние их окислительного статуса, наличие эндогенных или экзогенных радикалов, образования активных продуктов кислорода и азота. Экзогенные антиоксиданты могут модулировать тромбоцитарную активность [12]. Антиоксиданты, в частности тролокс и ресвератрол, потенциальные ингибиторы тромбоцитарной активации. Ингибиторный эффект ресвератрола, возможно, обусловлен ингибицией p38 MAP киназы, цитозольной фосфолипазы А2, арахидоновой кислоты, кальциевого каскада, активации NO, ингибиции фосфолипазы С и активатора протеин киназы С [10]. Указывается, что антиокислители, кроме неспецифических радикально подавляющих механизмов, могут ингибировать СРО за счет взаимодействия со специфическими белками. Подобная регуляция обозначается как рецептор-редокс регуляция.

Таким образом, АДФ-индуцированная активация тромбоцитов сопровождается активацией свободнорадикальных процессов с одновременной активацией антиокислительных систем. Тромбоциты, как в состоянии покоя, так и при АДФ-индуцированной агрегации, вырабатывают свободные радикалы, которые можно зарегистрировать методом хемилюминесценции.

Заключение

Регистрация собственного свечения тромбоцитов в присутствии люминола позволяет оценивать исходное состояние тромбоцитов. АДФ-индуцированная хемилюминесценция тромбоцитов позволяет установить функциональное состояние тромбоцитов, оценивая их способность образовывать свободные радикалы в процессе активации клеток.

Рецензенты:

Головлева Е.С., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии, ГБОУ ВПО ЮУГМУ Министерства здравоохранения РФ, г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии, ГБОУ ВПО ЮУГМУ Министерства здравоохранения РФ, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 18.04.2014.

Библиографическая ссылка