Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Крылова Е.А. 1 Катаев С.С. 1 Хомов Ю.А. 2

---

1 ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы»

2 ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Получены и представлены аналитические данные по идентификации различных дериватов метаболитов золпидема и продукта его гидролиза методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии с ионизацией электронным ударом (GC-MS-EI). Предложенная методика предполагает малый расход биологического объекта (2 мл мочи), проведение ферментативного гидролиза для разрушения конъюгатов метаболитов золпидема, применение для изолирования аналитов твердофазной экстракции (ТФЭ), которая выполняется на обращённо-фазном сорбенте со свойствами сильного катионита. Для дериватизации использовались различные реакции: ацилирования, алкилирования, получения триметилсилильных эфиров, – это позволило получить летучие, термостабильные дериваты метаболитов золпидема и продукта его гидролиза, обладающих специфической масс-фрагментацией. Примененные аналитические подходы позволили описать газохроматографические и масс-спектральные характеристики различных дериватов метаболитов золпидема и продукта его гидролиза, что дает возможность с высокой чувствительностью проводить их идентификацию в моче при выполнении химико-токсикологических и судебно-химических исследований.

Статья в формате PDF

332 KB

метаболиты золпидема

продукт гидролиза золпидема

твердофазная экстракция

дериватизация

газовая хроматография – масс-спектрометрия

1. Большой справочник лекарственных средств / под. ред. Л.Е. Зиганшиной, В.К. Лепахина, В.И. Петрова, Р.У. Хабриева. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – С. 988–989.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. – 16-е изд., перераб., испр. и доп. – М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2010. – С. 32.

3. Hariri B. L’influence du processus de putrifaction sur l’identification du zolpidem dans les bio-liquids / B. Hariri, E.A. Krylova, Y.A. Khomov // Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности: I Международн. науч. конф.: тез. докл. – Пермь, 2012. – С. 106–107.

4. Hempel G. Direct determination of zolpidem and its main metabolites in urine using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection / G. Hempel, G. Blaschke // Journal of Chromatography B. – 1996. – Vol. 675, № 1. – P. 131–137.

5. Lewis J.H. A simple and rapid method for the identification of zolpidem carboxylic acid in urine / J.H. Lewis, J.H. Vine // Journal of Analitical Toxocology. – 2007. – Vol. 31, № 4. – P. 195–199.

6. Thermospray liquid chromatography tandem mass spectrometry: application to the elucidation of zolpidem metabolism / S. Vajta [et al.] // Biomedical and Environmental Mass Spectrometry. – 1988. – Vol. 15(4). – P. 223–228.

Золпидем – это небензодиазепиновый снотворный препарат, химическое название –N,N,6-триметил-2-(4-метилфенил)имидазо[1,2-а]пиридин-3-ацетамид. Золпидем быстро всасывается в тонком кишечнике, имеет короткий период полувыведения (0,7–3,5 ч) [2], метаболизируется до фармакологически неактивных метаболитов и экскретируется в неизменном виде менее чем на 1 % [1, 4]. Поэтому очевидна необходимость определения именно метаболитов для эффективного выявления факта приема золпидема при проведении химико-токсикологического анализа (ХТА).

Золпидем в своей структуре содержит амидную связь, которая способна гидролизоваться с образованием продукта гидролиза золпидема. Обнаружение этого продукта может иметь большое значение при анализе длительно хранившейся мочи, когда за счет разложения мочевины происходит увеличение pH образца и, как следствие – гидролиз золпидема, что приводит к значительному снижению концентрации нативного вещества [3], которое и так выводится в следовых количествах.

Сведения по анализу метаболитов золпидема в мировой научной литературе единичны и представляют собой разрозненные и несистематизированные материалы. Метаболиты золпидема и продукт его гидролиза содержат в своей структуре полярные функциональные группы (–OH и –COOH), придающие аналитам свойства труднолетучих в условиях газовой хроматографии (ГХ) веществ (табл. 1).

Таблица 1

Метаболиты золпидема, продукт его гидролиза и их некоторые физико-химические характеристики

Поэтому для их исследования требуется получение летучих дериватов. В литературе описаны данные только о масс-фрагментации этильного деривата главного метаболита золпидема (4’-КЗ) [5], а также триметилсилильных производных 4’-ГМЗ, 6-ГМЗ, 4’-КЗ и 6-КЗ [6]. Данных о масс-спектрах различных производных продукта гидролиза золпидема в литературе не представлено.

Целью настоящей работы явилось изучение газохроматографических и масс-спектральных характеристик различных производных метаболитов золпидема и продукта его гидролиза после дериватизации с применением алкилирования метилйодидом, этанолом, изопропилйодидом, пентафторпропанолом, ацетилирования, получения триметилсилильных эфиров.

Материалы и методы исследования

Золпидема тартрат (порошок-субстанция, Испания, НД 42-13447-05); β-глюкуронидаза (Type HP-2, From Helix Pomatia, 101400 ЕД/мл, Sigma-ALDRICH Inc.); 2,2,3,3,3-пентафторпропанол и 2,2,3,3,3-пентафторпропионовый ангидрид («ICN Biomedicals», США); бис-триметилсилил-трифторацетамид (BSTFA), содержащий 1 % триметилхлорсилана (Sigma Chemical, Co; Sigma-ALDRICH CHEMI, Germany); метилйодид (Вектон, Шосткинский завод химреактивов), изопропилйодид (Вектон, Шосткинский завод химреактивов). Все используемые прочие растворители и реактивы имели чистоту х.ч. Применялись картриджи для ТФЭ AccuBond II EVIDEX и SampliQ Evidex – 200 мг – 3 мл (Agilent, США). Оборудование: газовый хроматограф Agilent 6850, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой НР-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Масс-селективный детектор Agilent 5973N (Agilent, США). Для твердофазной экстракции применяли: систему с вакуумной камерой (манифолд) на 12 позиций (Supelico), насос низкого вакуума (AIR CADET, США). Для выполнения реакции гидролиза и процедур дериватизации использовались термоблок ПЭ-4030 (ОАО «Экрос», Россия) и микроволновая печь Rolsen MS 1770 SA (Россия). При выполнении работы также применялись: микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия), полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4–40, 40–200, 200–1000 мкл и 1–5 мл. Исследовали образцы мочи испытуемых лиц, полученные после перорального приема однократной терапевтической дозы золпидема тартрата (10 мг). Параллельно анализировали контрольные образцы мочи, собранные у тех же лиц до приема золпидема тартрата. Полученные образцы мочи хранились при –20 °С, перед исследованиями мочу согревали до комнатной температуры.

Пробоподготовка образцов мочи: к 2 мл мочи прибавляют 0,5 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 6,0, 0,1 мл β-глюкуронидазы (10140 ЕД), перемешивают, герметично укупоривают и экспонируют в течение 2 часов при 45 °С. Полученный гидролизат центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут. Центрифугат отделяют от осадка, прибавляют 2,5 мл 1/15 М фосфатного буфера (pH 5,4) и подвергают ТФЭ по схеме: кондиционирование сорбента осуществляют последовательным промыванием 2 мл 95 % этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4. Загрузку анализируемого образца мочи осуществляют со скоростью 1,0 мл/мин, после чего промывают сорбент последовательным пропусканием через него растворов объемами по 1 мл: 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4; 0,1 М раствора уксусной кислоты и 3 мл 50 % раствора метанола в воде. Элюирование осуществляют в отдельный флакон со скоростью 1,0 мл/мин смесью дихлорметан–2-пропанол–25 % раствор аммиака (2:1:0,1) дважды порциями по 2 мл. Элюат испаряют досуха в токе азота при 60 °С.

Дериватизация метаболитов золпидема и продукта его гидролиза

Алкилирование метилйодидом (метилирование). К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 20–25 мг прокаленного калия карбоната, 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и выдерживали в термоблоке в течение 45 минут при 60 °С. После охлаждения виалы вскрывали, 200 мкл ацетонового раствора испаряли досуха в токе азота при 60 °С.

Алкилирование изопропилйодидом. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 20–25 мг прокаленного калия карбоната, 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл изопропилйодида и выдерживали в термоблоке в течение 45 минут при 60 °С. После охлаждения виалы вскрывали, 200 мкл ацетонового раствора испаряли досуха в токе азота при 60 °С.

Алкилирование пентафторпропанолом. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 25 мкл 2,2,3,3,3-пентафторпропанола и 75 мкл 2,2,3,3,3-пентафторпропионового ангидрида и далее реакционную смесь подвергали СВЧ-излучению мощностью 560 Вт в течение 5 мин. После охлаждения реагенты испаряли досуха в токе азота при 60 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата.

Ацетилирование. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида; реакционную смесь подвергали СВЧ-излучению мощностью 560 Вт в течение 5 мин. После охлаждения реагенты испаряли досуха в токе азота при 60 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата.

Силилирование. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 100 мкл бис-триметилсилил-трифторацетамида (БСТФА), содержащего 1 % триметилхлорсилана, герметично укупоривали и помещали в термоблок на 30 минут при 80 °С. После охлаждения виалы вскрывали и 1 мкл исследуемого раствора вводили в хромато-масс-спектрометр с использованием устройства для автоматического ввода проб.

Алкилирование этанолом проводили действием пентафторпропионового ангидрида при добавлении к образцу этанола; процедуру дериватизации осуществляли под действием СВЧ-излучения мощностью 560 Вт в течение 4 минут.

Газохроматографические и масс-спектральные условия: Режим работы ГХ/МС для проб в условиях скрининга: температура инжектора и интерфейса 250 и 280 °С, температура колонки: начальная 70 °С в течение 2 мин и прогрев до 280 °С со скоростью программирования 20 град/мин; выдержка при температуре 280 °С в течение 12 минут, затем прогрев до 300 °С со скоростью программирования 20 град/мин; выдержка при конечной температуре 5 мин. Ввод без деления потока газа-носителя. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования масс 45–450 а.е.

Результаты исследования и их обсуждение

Этап дериватизации сухих остатков после проведения ТФЭ из мочи необходим для дальнейшего определения методом ГХ полученных летучих производных метаболитов золпидема и продукта его гидролиза. Для определения гидроксиметаболитов золпидема возможно проведение ацетилирования, для карбоксиметаболитов и продукта гидролиза – алкилирования. Для всех метаболитов золпидема и продукта его гидролиза возможно получение их триметилсилильных эфиров.

В результате проведенных исследований стало возможным обнаружение метаболитов золпидема и продукта его гидролиза по полученным их газохроматографическим и масс-спектральным характеристикам, которые представлены в табл. 2.

Таблица 2

При интерпретации масс-спектров полученных производных была выявлена закономерность, характерная для производных основных метаболитов золпидема, заключающаяся в том, что при их масс-фрагментации образуются соответствующие молекулярные ион-радикалы и фрагментные ионы [M-72]+, имеющие выраженные пики на хроматограммах (рисунок).

Применение того или иного вида дериватизации в каждой отдельно взятой химико-токсикологической или судебно-химической лаборатории зависит от ее технического и материального оснащения, сложившихся традиционных предпочтений и имеющихся в наличии масс-спектральных библиотек. Но необходимо отметить, что получение ТМС-производных удобно на практике, т.к. силилирование позволяет одновременно в одной пробе получить триметилсилильные эфиры гидрокси- и карбоксиметаболитов золпидема, а также продукта его гидролиза.

Заключение

Применение различных способов дериватизации в сочетании с ТФЭ для последующего ГХ/МС анализа позволяет выявить при совместном присутствии золпидем, его метаболиты, а также продукт гидролиза, которые значительно различаются по физико-химическим свойствам. Без дериватизации продукт гидролиза золпидема и ни один из его метаболитов не обнаруживается. Методики могут быть использованы на практике врачами клинической лабораторной диагностики химико-токсикологических лабораторий и врачами судебно-медицинскими экспертами бюро судебно-медицинской экспертизы.

Схема образования и стабилизации иона [M-72]+ из молекулярного ион-радикала золпидема и производных его основных метаболитов (4’-ГМЗ, 6-ГМЗ, 4’-КЗ, 6-КЗ)

Рецензенты:

Михалев А.И., д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь;

Гейн В.Л., д.х.н., профессор, зав. кафедрой общей и органической химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.

Работа поступила в редакцию 26.03.2014.

Библиографическая ссылка