Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Осиков М.В. 1 Федосов А.А. 1 Суровяткина Л.Г. 2

---

1 ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России

2 МБУЗ ГКБ № 8

Ранее установленный нами протекторный эффект альфа-1-кислого гликопротеина (КГП) при острой почечной недостаточности (ОПН) в отношении количества, функциональной активности клеток крови, функции эндотелиоцитов, активности плазменных протеолитических систем и процессов свободно-радикального окисления может быть связан с его иммунорегуляторными свойствами. Цель работы – исследовать влияние КГП на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной ОПН – реализована на 96 белых нелинейных крысах. ОПН моделировали подкожным введением хлорида ртути (II) и верифицировали морфологическими и биохимическими методами. КГП в составе препарата «Орозин» (Челябинская областная станция переливания крови) применяли трехкратно в суммарной дозе 450 мг/кг. Исследования проводили на 5 сутки. Общепринятыми методами определяли количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, поглотительную способность фагоцитов, уровень общей гемолитической активности комплемента. Генерацию активных форм кислорода (АФК) фагоцитами оценивали с помощью спонтанной и индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции. Адаптивный иммунитет у крыс оценивали по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа и по количеству антителообразующих клеток в селезенке после повторной иммунизации аллогенными эритроцитами. Установлено, что при ОПН наблюдается нейтрофильный и лимфоцитарный лейкоцитоз в периферической крови, активация поглотительной и киллинговой способности фагоцитов, активация системы комплемента, подавление клеточного и усиление гуморального адаптивного иммунного ответа. Применение КГП при ОПН приводит к восстановлению количества лейкоцитов в крови, снижению фагоцитарной способности, включая генерацию АФК, снижению активности системы комплемента, восстановлению Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа.

Статья в формате PDF

296 KB

альфа-1-кислый гликопротеин

иммунный статус

почечная недостаточность

1. Лютов А.Г. Получение α1-кислого гликопротеина из отходов производства альбумина / А.Г. Лютов, В.А. Алешкин, С.А. Еникеева и др. // Гематология и трансфузиология. – 1987. – Т. 32, № 5. – С. 58–61.

2. Осиков М.В. Влияние гемодиализа на процессы свободно-радикального окисления у больных хронической почечной недостаточностью / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.В. Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2007. – № 16 (71). – С. 95–97.

3. Осиков М.В. Влияние альфа1-кислого гликопротеина на процессы свободно-радикального окисления при экспериментальной печеночной недостаточности / // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 29–31.

4. Осиков М.В. Гемостазиологические эффекты альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном септическом перитоните / М.В. Осиков, Е.В. Макаров, Л.В. Кривохижина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 8. – С. 143–145.

5. Осиков М.В. Роль орозомукоида в регуляции активности систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности // Бюллетень экспе­риментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 7. – С. 27–30.

6. Осиков М.В. Роль эритропоэтина в коррекции нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 9–3. – С. 462–466.

7. Осиков М.В. Эфферентные и антиоксидантные свойства эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, Ю.И. Агеев // Эфферентная терапия. – 2011. – Т. 17, № 4. – С. 7–13.

8. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Д.А. Козочкин, М.А. Ильиных // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6; URL: www.science-education.ru/106-7450 (дата обращения: 23.02.2014).

9. Осиков М.В. К механизму иммунотропных эффектов эпидермального фактора роста у больных с термической травмой / М.В. Осиков, А.Г. Лихачева // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012. – № 4 (41). – С. 211–212.

10. Осиков М.В. Эритропоэтин как регулятор экспрессии тромбоцитарных гликопротеинов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Д.А. Козочкин, М.А. Ильиных // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1; URL: www.science-education.ru/107-7731 (дата обращения: 23.02.2014).

11. Осиков М.В. Современные представления о гемостазиологических эффектах эритропоэтина / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5–1. – С. 196–200.

12. Ceciliani F. The acute phase protein α-acid glycoprotein: a model for altered glycosylation during diseases / F. Ceciliani, V. Pocacqua // Curr. Protein. Pept. Sci. – 2007. – Vol. 8, № 1. – P. 91–108.

13. Gstraunthaler G. Glutathione depletion and in vitro lipid peroxidation in mercury or maleate induced acute renal failure / G. Gstraunthaler, W. Pfaller, P. Kotanko // Biochem. Pharmacol. – 1983. – Vol. 32, № 19. – P. 2969–2972.

14. Mahajan S. Phagocytic polymorphonuclear function in patients with progressive uremia and the effect of acute hemodialysis / S. Mahajan, O.P. Kalra, K.T. Asit et al. // Ren. Fail. – 2005. – Vol. 27, № 4. – P. 357-–360.

15. Osikov M.V. Effects of α1-acid glycoprotein on hemostasis in experimental septic peritonitis / M.V. Osikov, E.V. Makarov, L.V. Krivokhizhina // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2007. – № 2. – Р. 178–180.

Изменения иммунного статуса организма являются ключевым фактором патогенеза при многих заболеваниях и типовых патологических процессах. Факторы врожденного и адаптивного иммунитета могут выступать в качестве мишеней, эффекторов и регуляторов изменения гомеостаза при патологии. Взаимосвязь между составными частями иммунной системы осуществляется посредством цитокинов, гормонов, аутокоидов и др. соединений. В связи с этим актуальной и востребованной в клинических условиях проблемой современной фундаментальной медицины является поиск регуляторов гомеостаза, в том числе иммунного ответа, эндогенной природы. В качестве регуляторов могут выступать реактанты острой фазы, для которых характерна специфическая временная динамика, определяющая активацию или ингибицию отдельных клеточных и гуморальных представителей иммунной системы. Вызывает интерес участие реактантов острой фазы в регуляции врожденного и адаптивного иммунитета при изменении гомеостаза. Ранее нами продемонстрировано участие церулоплазмина, альфа-1-кислого гликопротеина, эритропоэтина, эпидермального фактора роста в регуляции функциональной активности клеток крови, эндотелиоцитов, плазменных протеолитических систем, процессов свободно-радикального окисления при различной патологии в клинических и экспериментальных условиях [4–11, 15]. Протекторный эффект альфа-1-кислого гликопротеина (КГП) может быть связан с его иммунорегуляторными свойствами. Цель работы – исследовать влияние КГП на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной почечной недостаточности.

Материалы и методы исследования

Эксперимент выполнен на 96 белых нелинейных крысах массой 200–240 г. в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.) и положениями Хельсинской Декларации ВОЗ (1997). ОПН моделировали подкожным однократным введением хлорида ртути (II) [13]. Развитие ОПН верифицировали на основании результатов морфологических и биохимических исследований. Критериями служили некроз эпителия канальцев нефрона, статистически значимое увеличение концентрации в сыворотке мочевины и креатинина. КГП применяли трехкратно через 48 ч, 72 ч и 96 ч от индукции ОПН, суммарная доза КГП – 450 мг/кг. Исследования проводили на 5 сутки. Для выяснения иммунотропных эффектов КГП использовали препарат «Орозин» (Челябинская областная станция переливания крови). Согласно технологии препарат «Орозин» получали из отходов производства альбумина [1]. Общепринятыми методами определяли количество лейкоцитов в периферической крови, лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках крови, окрашенных азур II-эозином по методу Романовского-Гимза. Фагоцитарную способность лейкоцитов периферической крови оценивали по поглощению частиц монодисперсного (1,7 мкм) полистирольного латекса, учитывали активность (% клеток) и интенсивность (у.е./клетку) фагоцитоза. Уровень общей активности комплемента в плазме определяли методом титрования по 50 % гемолизу, результат выражали в у.е. 50 % гемолиза (СН50, у.е.). Для оценки генерации активных форм кислорода (АФК) фагоцитами периферической крови использовали метод хемилюминесценции (ХЛ), исследования проводили в среде, содержащей 2 мл фосфатно-солевого раствора с люминолом (1∙10–6 М) и 0,1 мл крови. Регистрировали спонтанное и индуцированное свечение, на хемилюминограммах оценивали светосумму свечения (у.е.∙мин). Клеточный Т-хелпер-1-зависимый иммунный ответ исследовали по реакции гиперчувствительности замедленного типа, интенсивность ГЗТ у крыс оценивали по выраженности воспалительного отека стопы после повторной иммунизации аллогенными эритроцитами, используя волюмометрический подход. Гуморальный Т-хелпер-2-зависимый иммунный ответ оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, Краскела-Уоллиса.

Результаты исследования и их обсуждение

При экспериментальной ОПН в периферической крови развивается лейкоцитоз, обусловленный повышением количества зрелых нейтрофилов и лимфоцитов (табл. 1).

Полагаем, что лейкоцитоз обусловлен активацией костного мозга за счет мобилизации и синтеза лейкоцитов в ответ на повреждение тканей почек. При оценке функциональной активности лейкоцитов отмечено усиление способности фагоцитов захватывать частицы латекса. Генерация АФК в пересчете на фагоцит возрастает более чем в 2 раза как в спонтанном режиме, так и при стимуляции. Полагают, что ключевые этапы фагоцитарного процесса при уремии неоднозначны и зависят от длительности и выраженности уремической интоксикации. Увеличение более чем в 5 раз генерации АФК фагоцитами отмечено у больных с уремией, одновременно повышается содержание внутриклеточной миелопероксидазы и активность апоптоза [2, 14]. Как возможный механизм усиления продукции АФК нейтрофилами рассматривается накопление в уремической плазме метилглиоксаля. Увеличение генерации АФК фагоцитами при ОПН может быть связано с возрастанием в периферической крови сегментоядерных нейтрофилов – основных продуцентов АФК. Кроме этого, ранее нами установлено, что мочевина, но не креатинин вносит определенный вклад в повышение ХЛ лейкоцитов при ОПН. Несмотря на то, что мочевину традиционно рассматривают в качестве водорастворимого антиоксиданта, ее влияние на процессы свободно-радикального окисления зависит от дозы и времени контакта с клетками или плазмой. Прооксидантный эффект реализуется при концентрации мочевины от 10 ммоль/л и выше и связан со снижением активности СОД и каталазы. При ОПН повышается активность системы комплемента. Полагают, что накопление уремических токсинов в крови приводит к активации системы комплемента по альтернативному пути с отложением С3 вдоль канальцев нефрона.

Специфический иммунный ответ крыс исследовали по показателям ГЗТ (клеточный иммунный ответ) и количеству АОК в селезенке (гуморальный иммунный ответ) на 5 сутки после иммунизации эритроцитами барана. При ОПН зафиксирован дуализм адаптивного иммунного ответа, связанный с подавлением клеточного иммунитета и стимуляцией гуморального (табл. 2).

Таблица 1

Влияние КГП на показатели врожденного иммунитета при ОПН (M ± m)

Примечания: здесь и в табл. 2 * – статистически значимые (р < 0,05) различия с группой 1; ** – с группой 2 по критериям Краскела–Уоллиса, Манна–Уитни, Вальда-Вольфовитца.

Таблица 2

Влияние КГП на показатели адаптивного иммунитета при ОПН (M ± m)

Первые сообщения об иммунодефиците при уремии появились достаточно давно. Полагали, что Т-клеточная дисфункция при уремии связана с нарушением процесса пролиферации Т-клеток. Исследования последних лет подтвердили представления о преимущественном повреждении при уремии клеточного иммунитета, расстройствах Т-клеточной активации. Показано, что наиболее вероятной причиной такой дисфункции является снижение экспрессии костимулирующих молекул В7-2 (CD86) на поверхности уремических моноцитов на 30–40 % по сравнению с нормой. Первичный характер дисфункции антигенпрезентирующих клеток при уремии подтверждается исследованиями in vitro, при сохраненной костимуляции функциональная активность Т-клеток при уремии не нарушается. Полагают, что одним из механизмов нарушения активности Т-клеток является снижение продукции фактора роста Т-клеток интерлейкина-2 и/или других цитокинов в условиях повреждения процесса костимуляции.

Применение КГП при ОПН уменьшает количество лейкоцитов в крови до уровня интактных животных, эффект КГП связан со снижением представительства в крови лимфоцитов (табл. 1). КГП выступает в роли регулятора функции фагоцитов и иммуноцитов при ОПН (табл. 1, 2). В условиях применения КГП функциональная активность фагоцитов нормализуется или приближается к норме: снижается интенсивность фагоцитоза, генерация АФК фагоцитами снижается, причем функциональный резерв фагоцитов, оцениваемый по показателям индуцированной ХЛ, становится ниже нормы. В условиях применения КГП при ОПН снижается, но не достигает значений в группе интактных животных активность системы комплемента.

Характер действия КГП может быть связан с гетерогенностью молекулярного строения и присутствием в составе препарата «Орозин» различных фракций КГП [12]. Фракция КГП, содержащая молекулы с «недостроенными» двухантенными углеводными цепями, оказывает провоспалительный эффект, молекулы с трех- и четырехантенными цепями обладают противоположным действием [3]. Таким образом, КГП регулирует активность фагоцитов по принципу отрицательной обратной связи прямым или опосредованным образом. На роль одного из механизмов претендует изменение функции эндотелиоцитов. Необходимо отметить, что в самих лейкоцитах происходит синтез КГП. ИЛ-1бета и TНФ-альфа при введении их в культуру мононуклеаров через 18–24 часа вызывают экспрессию мРНК, ответственной за синтез КГП. Синтез КГП активированными фагоцитами in situ создает предпосылки для прямого действия КГП.

КГП активно вмешивается в реализацию специфических механизмов защиты организма. Как и в отношении фагоцитов, суммарный результат действия КГП на показатели клеточного и гуморального иммунитета носит модулирующий характер. КГП увеличивает интенсивность реакции ГЗТ, после введения КГП показатели приближались к значениям интактных животных, снижает повышенное количество АОК в селезенке до уровня интактных животных.

Итак, иммунотропная активность КГП проявляется на правах регуляции: препарат стимулирует сниженные или неизменные показатели, но подавляет увеличенные, функционируя в качестве эндогенного иммуномодулятора. Полагаем, что обнаруженные иммунотропные эффекты КГП, в том числе, могут быть опосредованы цитокинами. Boutten A. et al. показали, что КГП в дозе 250 мкг/мл – 500 мкг/мл усиливает синтез ИЛ-1, ИЛ-6 и TНФ-альфа человеческими моноцитами, но только в присутствии липополисахарида E. Coli. Su S.J. et al. опровергают факт опосредованной стимуляции моноцитов КГП и сообщают о его способности самостоятельно увеличивать продукцию TНФ-альфа. КГП повышает синтез перитонеальными макрофагами фактора, ингибирующего активность ИЛ-1, что отражает феномен отрицательной обратной связи в регуляции продукции ИЛ-1 клетками. Ранее нами установлено, что КГП повышает продукцию мононуклеарами периферической крови ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, снижает синтез ИЛ-3. Эффекты КГП статистически значимо проявились в диапазоне доз 50–100 % от его физиологического уровня в крови. Таким образом, изменяя концентрацию ключевых цитокинов, КГП может вмешиваться в реализацию врожденных и адаптивных защитных механизмов через регуляцию количества, активацию или подавление функциональной активности иммунокомпетентных и вспомогательных клеток.

Выводы

1. При экспериментальной ОПН наблюдается нейтрофильный и лимфоцитарный лейкоцитоз в периферической крови, активация поглотительной и киллинговой способности фагоцитов, активация системы комплемента, подавление клеточного Th1-зависимого и усиление гуморального Th2-зависимого иммунного ответа.

2. Применение при экспериментальной ОПН альфа-1-кислого гликопротеина в суммарной дозе 450 мг/кг оказывает иммунорегуляторный эффект: восстанавливается количественный состав лейкоцитов в периферической крови, снижается фагоцитарная способность лейкоцитов, включая генерацию активных кислородных метаболитов, снижается активность системы комплемента, восстанавливается Th1-зависимый и Th2-зависимый иммунный ответ.

Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;

Гизингер О.А., д.б.н., профессор кафед­ры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 14.03.2014.

Библиографическая ссылка