Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Махнева Н.В. 1, 2 Давиденко Е.Б. 1 Белецкая Л.В. 1

---

1 Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения города Москвы

2 Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Аутоиммунная пузырчатка – это группа аутоиммунных буллезных заболеваний с вовлечением в патологический процесс органов, покрытых или выстланных многослойным плоским эпителием. Патогенетическая роль принадлежит специфическим аутоантителам, направленным против антигенов-мишеней десмосомального аппарата (межклеточная связывающая субстанция) эпидермиса. Антитела аутоиммунной пузырчатки обнаруживаются у больных на всем протяжении развития патологического процесса. Циркулирующие аутоантитела и фиксированные иммунные комплексы выявляются у больных и в стадии клинической ремиссии на фоне поддерживающей дозы глюкокортикостероидов. Вопрос о том, что же способствует поддержанию аутоиммунного процесса, остается до сих пор открытым. С помощью прямого и непрямого методов иммунофлюоресценции были обследованы 11 больных аутоиммунной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии. Результаты иммунологического исследования больных продемонстрировали поликлональность гуморального ответа с наличием широкого спектра аутоантител. Изучение антигенов-мишеней продемонстрировало присутствие специфических IgG-аутоантител с преобладанием IgG4, направленных преимущественно к антигенам десмосомального аппарата базального слоя эпидермиса, что свидетельствует о наличии в этой структуре постоянно присутствующего фактора, способствующего постоянной выработке аутоантител.

Статья в формате PDF

913 KB

аутоиммунная пузырчатка

патогенез

иммуноглобулин G

субклассы иммуноглобулина G

антигены-мишени

1. Белецкая Л.В., Данилова Т.А. Метод иммунофлюоресценции в иммунопатологии // Иммунолюминесценция в медицине / под ред. Е.Н. Левиной.  – М.: Медицина, 1977. – С. 145–183.

2. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Выявление растворимых иммунных комплексов в тканях биопсии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1995. – № 11. – С. 545–547.

3. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Меченые антитела в нормальной и патологической морфологии (атлас). – М.: МНИПИ, 2000. – 108 с.

4. Махнева Н.В. Клинические и патогенетические аспекты иммуноморфологических исследований материала больных пузырчаткой и другими буллезными дерматозами: автореф. дис. ... д-ра мед. наук // специальности 14.00.11 – Кожные и венерические болезни, 14.00.36 – Аллергология и иммунология. – М., 1997. – 183 с.

5. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Иммунопатологические аспекты аутоиммунных буллезных дерматозов // Palmarium academic publishing. – 2012. – 408 с.

6. Потекаев Н.С. Дерматовенерология – синтез науки и практики (избранные труды). –М.: Медицина, 2004. – 560 с.

7. Свирщевская Е.В., Матушевская Е.В. Иммунопатогенез и лечение пемфигуса // Русский медицинский журнал. – 1998. – № 6. – С. 275–378.

8. Теплюк Н.П. Совершенствование глюкокортикостероидной терапии истинной акантолитической пузырчатки с учетом оценки функционального состояния системы гипофиз-надпочечники и цитокинового профиля: автореф. дис. ... д-ра мед. наук // специальности 14.01.10 – Кожные и венерические болезни. – М., 2010. – 43 с.

9. Grob P.J., Inderbitzin T. M. Experimental production in rabbits of antiepithelial autoantibodies // J. Invest. Dermatol. – 1967. – Vol.49. – № 6. – P. 637–641.

10. Inderbitzin T.M., Grob P.J. Acantholysis in pemphigus, an immunologic phenomen // Int. Arch. Allergy. – 1968. – Vol. 33. – P. 576–582.

11. Martin L.K., Murrell D.F. Treatment of pemphigus: the need for more evidence // Arch. Dermatol. – 2008. – Vol. 144. – № 1. – P. 100–101.

Аутоиммунная пузырчатка – это группа аутоиммунных буллезных заболеваний с вовлечением в патологический процесс органов, покрытых или выстланных многослойным плоским эпителием. Патогенетическая роль принадлежит специфическим аутоантителам, направленным против антигенов-мишеней десмосомального аппарата (межклеточная связывающая субстанция, МСС) эпидермиса [6, 7]. Для подавления иммунопатологического процесса применяется иммуносупрессивная терапия пожизненно [8, 11]. По многолетним клиническим наблюдениям полная отмена глюкокортикостероида, даже после длительной клинической ремиссии на поддерживающей его дозе, всегда приводит к обострению (возобновлению) аутоиммунной пузырчатки. Причина, способствующая сохранению аутоиммунного процесса, пока не известна и требует продолжения детального изучения патогенеза данного буллезного дерматоза.

Цель исследования ‒ определение специфических аутоантител и фиксированных иммунных комплексов у больных аутоиммунной пузырчаткой в стадии ее клинической ремиссии.

Материалы и методы исследования

Были изучены образцы сывороток крови и биоптатов клинически интактных участков кожи 11 больных аутоиммунной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии с использованием прямого и непрямого методов иммунофлюоресценции. Диагноз каждого больного ранее был подтвержден прямым методом иммунофлюоресценции (выявлена фиксация IgG в межклеточных пространствах эпидермиса).

Среди обследуемых больных, страдающих аутоиммунной пузырчаткой, было 8 женщин и 3 мужчин в возрасте от 26 до 73 лет (средний возраст 56 ± 13 лет). Продолжительность болезни составляла от 3 до 16 лет, длительность клинической ремиссии – от полугода до 8 лет (в среднем 3,15 ± 2,5 года). Поддерживающая доза глюкокортикостероидов носила индивидуальный характер, от 5 до 20 мг/сутки в перерасчете на преднизолон.

При осмотре клиническая картина пузырчатки в стадии клинической ремиссии представлена пятнами гиперпигментации на месте разрешившихся высыпаний и атрофией кожи. Больные обращали внимание на слабую прочность кожного покрова, неустойчивость ее к механическим повреждениям и длительное заживление раневых поверхностей с формированием рубцов.

С целью выявления фиксированных иммунных комплексов в клинически интактных участках кожи обследуемых больных применяли классический прямой метод иммунофлюоресценции [1, 4, 5] с использованием моноспецифических люминесцирующих сывороток против основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. М.Ф. Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва), люминесцирующих сывороток против С3 компонента комплемента (CHEMICON, Австралия), фибриноген/фибрина (DAKO CYTOMATION, Дания) и моноклональных антител к субклассам IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) (SIGMA-ALDRICH, USA).

В случае отсутствия или слабой специфической иммуногистохимической реакции в МСС эпидермиса с целью выявления растворимых иммунных комплексов использовали модифицированный прямой метод иммунофлюоресценции, сущность которого заключается в предварительной обработке криостатных срезов стабилизирующим 40 % раствором этанола в течение 1 минуты [2, 4, 5]. Далее партии срезов обрабатывали аналогично классическому прямому методу иммунофлюоресценции.

С целью выявления циркулирующих IgG-аутоантител в сыворотке крови обследуемых больных использовали непрямой метод иммунофлюоресценции [1, 3, 4] с применением люминесцирующей сыворотки против IgG (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. М.Ф. Гамалеи АМН РФ). В случае выявления циркулирующих специфических IgG-аутоантител к МСС эпидермиса, сыворотки обследованных пациентов дополнительно были исследованы с использованием моноклональных антител к субклассам IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) (SIGMA-ALDRICH, USA). В качестве субстрата использовали кожу теленка.

Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании в сыворотке крови у 7 (63,6 %) из 11 обследованных больных выявлены специфические IgG-аутоантитела в титрах от 1:5 до 1:320. Мишенями во всех семи (100 %) случаях были антигены МСС базального слоя эпидермиса и эпителия волосяных фолликулов (рисунок, a). У двух больных дополнительно антигеном-мишенью служила МСС шиповатого слоя с более выраженной иммунологической реакцией в МСС базального слоя эпидермиса. Кроме того, у всех обследованных больных в сыворотке крови выявлены сопутствующие антитела к различным структурам ткани: к поверхностным белкам недифференцированных и дифференцированных кератиноцитов, различным компонентам базальной мембраны эпидермиса, дермо-эпидермального соединения и ретикулярного слоя дермы, ядрам клеточных элементов и стенке сосудов дермы. При этом титр циркулирующих аутоантител к антигенам разных тканевых структур больных составлял от 1:5 до 1:1280, т.е. выше уровня естественных антител. Наличие широкого спектра аутоантител при аутоиммунной пузырчатке еще раз подтверждает серьезность этой патологии.

Субклассовая характеристика циркулирующих IgG-аутоантител продемонстрировала их поликлональность с участием IgG1-, IgG2-, IgG3- и IgG4-аутоантител к различным структурам многослойного плоского эпителия в 71,4; 100; 85,7; 57,1 % случаях соответственно. При этом МСС (десмосомальный аппарат) базального и шиповатого слоев эпидермиса служила мишенью для циркулирующих IgG1-, IgG2-, IgG3- и IgG4-аутоантител в 20; 42,9; 16,7; 100 % случаях соответственно (рисунок, b). Следует отметить, что для IgG2-аутоантител во всех (100 %) случаях дополнительно мишенью служила и МСС зернистого слоя эпидермиса (рисунок, с). Это совпадает с локализацией сывороточного С3 компонента комплемента, что свидетельствует о связи комплемента с неполным иммунным комплексом и его участии в качестве дополнительного фактора, в частности, при переходе одной клинической формы пузырчатки в другую [5]. Кроме того, преобладание IgG2/IgG4-антител свидетельствует о хронической антигенной стимуляции с участием системы комплемента, активируемым классическим путем.

В клинически интактных участках кожи 10 обследуемых больных аутоиммунной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии в 90 % случаях выявлен фиксированный IgG в МСС базального и шиповатого слоев эпидермиса как в растворимой (50 %), так и в нерастворимой (40 %) формах с наиболее выраженной иммуногистохимической реакцией в МСС базального слоя эпидермиса (рисунок, d). При этом в данных структурах ткани присутствовало от одного до трех субклассов IgG (IgG1 – 22,2 %, IgG2 – 11,1 %, IgG4 – 88,9 %) без участия IgG3 (рисунок, e).

          a                                      b                                   c

                       d                                               e

Иммуногистохимическое исследование материала больных аутоиммунной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии. х 400: a–c – криостатные срезы кожи теленка. Обработка сывороткой больной аутоиммунной пузырчаткой. Непрямой метод иммунофлюоресценции: a – циркулирующие IgG-аутоантитела к МСС базального слоя многослойного плоского эпителия волосяного фолликула; b – циркулирующие IgG4-аутоантитела к МСС базального и шиповатого слоев эпидермиса; c – циркулирующие IgG2-аутоантитела к МСС зернистого слоя эпидермиса; d–e – криостатные срезы кожи больных аутоиммунной пузырчаткой: d – обработка меченой сывороткой против иммуноглобулина класса G человека. Модифицированный прямой метод иммунофлюоресценции. Фиксация IgG в МСС базального и шиповатого слоев эпидермиса с выраженной иммунофлюоресцентной реакцией в базальном слое; e – обработка моноклональными антителами к IgG4. Классический прямой метод иммунофлюоресценции. Фиксация IgG4 в МСС преимущественно базального слоя эпидермиса

Обращает на себя внимание факт, что в клинически интактных участках кожи обследованных больных антигеном-мишенью для фиксированного IgG всегда служила межклеточная связывающая субстанция базального слоя эпидермиса. В рутинной практике чаще всего при изучении иммуногистохимической картины аутоиммунной пузырчатки обращают внимание на МСС шиповатого и зернистого слоев эпидермиса. Это связано с тем, что в активный период иммунопатологического процесса отмечается наиболее выраженная иммунофлюоресцентная реакция связывания аутоантител и фиксации иммунных комплексов с антигенами-мишенями МСС многослойного плоского эпителия именно шиповатого и зернистого слоев эпидермиса. Тем не менее данные нашей экспериментальной работы продемонстрировали присутствие специфических IgG-аутоантител к антигенам десмосомального аппарата базального слоя эпидермиса, что свидетельствует о наличии в этой структуре постоянно присутствующего фактора, способствующего выработке аутоантител.

Еще в 60-х годах ХХ столетия экспериментально путем иммунизации животных (кроликов) эпителиальным антигеном эпителия пищевода продемонстрирована продукция специфических аутоантител к антигенам межклеточной связывающей субстанции либо только базального слоя, либо всех слоев многослойного плоского эпителия [10]. In vitro эти антитела были идентичны аутоантителам, присутствующим в сыворотке больных аутоиммунной пузырчаткой. При этом in vivo в коже и пищеводе иммунизированных кроликов не происходило связывания антиэпителиальных антител [9]. Эти данные свидетельствуют о существовании дермо-эпидермального барьера, способного предупреждать разрушительное действие этих антиэпителиальных антител в экспериментах in vivo.

Подобные исследования и наши наблюдения наводят на мысль о существовании ключевой роли десмосомального аппарата базального слоя эпидермиса в развитии аутоиммунной пузырчатки. По-видимому, в данной структуре эпидермиса присутствует фактор, который является причиной поддержания и активации аутоиммунного процесса с постоянной выработкой аутоантител. При этом проводимая массивная иммуносупрессивная терапия способствует только подавлению иммунопатологического процесса, но не устранению фактора тканевой структуры.

Заключение

Результаты иммунологического исследования аутоиммунной пузырчатки в стадии клинической ремиссии продемонстрировали поликлональность гуморального ответа с наличием широкого спектра аутоантител. Доминирующую патогенетическую роль играют IgG2/IgG4-аутоантитела, что свидетельствует о хронической антигенной стимуляции преимущественно гликопротеиновой природы. Мишенью для IgG2-аутоантител являются антигены десмосомального аппарата зернистого слоя эпидермиса, а для IgG4-аутоантител – антигены десмосомального аппарата базального и шиповатого слоев эпидермиса. При этом десмосомальный аппарат базального и шиповатого слоев эпидермиса служит антигеном-мишенью и для фиксированного IgG с преобладанием IgG4.

Выявленный факт участия десмосомального аппарата базального слоя эпителия при аутоиммунной пузырчатке требует молекулярно-биологического подхода в изучении данной структуры ткани. Это позволит приблизиться к пониманию «тонких» механизмов развития аутоиммунного буллезного дерматоза, тем самым создавая условия для разработки новых патогенетически обоснованных терапевтических схем лечения. Приближаясь к генетическому уровню (выявление и оценка экспрессии генов), задачей современной медицины является вмешательство в геном или эпигеном с целью возможности коррекции синтеза того или иного молекулярно-биологического соединения. И эта проблема будущего.

Матушевская Е.В., д.м.н., профессор кафедры дерматовенерологии и косметологии, ФГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства», г. Москва;

Авдеева Ж.И., д.м.н., профессор, главный эксперт Центра экспертизы и контроля иммунобиологических препаратов, ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 18.02.2014.

Библиографическая ссылка