Хроническая почечная недостаточность (ХПН) – клинико-лабораторный синдром, вызванный необратимой гибелью нефронов и проявляющийся прогредиентным поражением различных органов и систем, в том числе кроветворения и иммуногенеза. Ранее нами продемонстрированы изменения у больных ХПН в системе гемостаза, функционального состояния вегетативного и соматического отделов нервной системы, иммунного статуса, процессов свободно-радикального окисления [1–10]. Следует учитывать, что развитие сердечно-сосудистой, инфекционной патологии, заболеваний воспалительного генеза у данной категории больных связано с дисфункцией иммунной системы в связи с изменением количественного состава, функциональной активности и кооперации между полиморфно-ядерными лейкоцитами, моноцитами/макрофагами, другими антигенпрезентирующими клетками и лимфоцитами [11]. В частности, депрессия адаптивного звена иммунитета является ведущим механизмом развития инфекционной патологии, а активация врожденного звена иммунитета и связанная с ней манифестация локального и системного воспаления способствует развитию и прогрессированию сердечно-сосудистых заболеваний. Одним из механизмов дисфункции иммунного ответа может выступать изменение апоптоза иммунокомпетентных клеток, что, с одной стороны, может способствовать элиминации активированных фагоцитов, с другой – приводить к прогрессированию иммунной недостаточности, т.е. дисбаланс между про- и антиапоптогенными механизмами может занимать ключевую позицию в патогенезе осложнений при ХПН. Цель работы – исследовать влияние плазмы крови больных ХПН на выраженность апоптоза лимфоцитов.
Материалы и методы исследования
Для реализации поставленной цели использована кровь больных людей с ХПН-пациентов отделения диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Первоначально обследовано 150 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 21 до 60 лет, получающих гемодиализную терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы Fresenius (Германия) 3 раза в неделю в течение 4 часов. Критерии исключения:
1) больные после трансплантации почки;
2) наличие на момент исследования гнойно-септических осложнений;
3) наличие у больных увеличенных лимфатических узлов любой локализации;
4) больные, принимающие глюкокортикостероидную и/или цитостатическую терапию;
5) злокачественные и доброкачественные опухоли любой локализации;
6) ВИЧ-инфекция, гепатит С, гепатит В;
7) аутоиммунные и/или аллергические заболевания. После рандомизации в исследование включено 14 больных.
Кровь для исследований у больных забиралась из артериального колена артериовенозной фистулы до процедуры гемодиализа. Группа контроля (n = 14) представлена клинически здоровыми людьми-добровольцами, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основной группой. Для изучения влияния плазмы больных ХПН на апоптоз интактных лимфоцитов проведен эксперимент в условиях in vitro. В суспензию лимфоцитов здоровых людей добавляли аутологичную плазму (контроль) или плазму больных ХПН (опыт), после чего инкубировали в условиях термостата при 37 °С в течение 30 мин. Лимфоциты из периферической крови выделяли на двойном градиенте плотности фиколла и урографина, концентрацию лимфоцитов в суспензии доводили до 3·106/л. Апоптоз лимфоцитов оценивали при окрашивании конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 – FITC/7-AAD kit» («Beckman Coulter», США) на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США) с дифференцировкой интактных клеток (Annexin-5-FITC–/7-AAD–), клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), клеток с поздними признаками апоптоза и частично некротических клеток (Annexin-5-FITC+/7-AAD +), клеток с признаками некроза (Annexin-5-FITC–/7-AAD +). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Манна‒Уитни, Вальда-Вольфовитца, Вилкоксона.
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что у больных ХПН в периферической крови снижается количество лимфоцитов без признаков некроза и апоптоза (Annexin-5-FITC–/7-AAD–) за счет увеличения количества клеток, несущих признаки раннего апоптоза, позднего апоптоза и некроза (табл. 1). Наблюдается увеличение количества лимфоцитов, экстернализирующих на наружной поверхности мембраны фосфатидилсерин (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), на 63 %, экстернализирующих фосфатидилсерин и одновременно проницаемых для катионного красителя (Annexin-5-FITC+/7-AAD+) – на 640 %, только проницаемых для катионного красителя (Annexin-5-FITC–/7-AAD+) – на 383 %. Таким образом, гибель лимфоцитов при ХПН обусловлена процессами апоптоза и некроза клеток. Ранее нами было показано, что у больных с терминальной стадией ХПН снижается количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций, В-лимфоцитов, NK-клеток в периферической крови [9]. Снижение количества лимфоцитов в крови приводит к дефициту клеточного и гуморального адаптивного иммунитета, дефектам презентации антигенов иммунокомпетентным клеткам и, как следствие, росту заболеваемости и неблагоприятным исходам различной инфекционной патологии при ХПН.
Другими исследователями показано, что неоднозначные результаты при оценке апоптоза лимфоцитов у больных ХПН связаны с видом заместительной терапии (гемодиализ или перитонеальный диализ), биосовместимостью мембраны диализатора, скоростью потока диализной жидкости и др. факторами. Установлено, что наличие маркеров апоптоза в Т-лимфоцитах (аннексин V, CD95+, фрагментация ДНК) коррелирует с признаками их ранней активации (CD69 +) и усиливается процедурой гемодиализа. С использованием метода измерения длины теломер у больных ХПН установлено преждевременное старение CD8 + Т-лимфоцитов [14]. В-лимфопения у больных терминальной ХПН может быть связана с гибелью клеток путем апоптоза в связи с пониженной экспрессией Bcl-2, повышенной экспрессией длинной изоформы BLNK (B cell LiNKer protein), которая подавляет активацию митоген-активируемой протеинкиназы р38, JNK, повышает экспрессию с-Fos и активирует BCR-индуцированный апоптоз В-лимфоцитов. При использовании метода ПЦР в реальном времени показано, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, а также в преддиализной группе по сравнению со здоровыми людьми значительно повышен уровень мРНК длинной изоформы BLNK [13].
Таблица 1
Показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных ХПН (M ± m)
Показатели |
Лимфоциты здоровых людей (n = 14) |
Лимфоциты больных с ХПН (n = 14) |
Интактные клетки, % клеток |
80,83 ± 0,83 |
68,33 ± 2,17 * |
Ранний апоптоз, % клеток |
19,06 ± 0,82 |
31,05 ± 2,12 * |
Поздний апоптоз, % клеток |
0,05 ± 0,01 |
0,37 ± 0,05 * |
Некроз, % клеток |
0,06 ± 0,01 |
0,29 ± 0,04 * |
Примечание. * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой здоровых людей.
Таблица 2
Влияние плазмы больных ХПН на показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови здоровых людей (M ± m)
Показатели |
Группа 1 Лимфоциты здоровых людей + плазма здоровых людей (n = 14) |
Группа 2 Лимфоциты здоровых людей + плазма больных ХПН (n = 14) |
Интактные клетки, % клеток |
80,83 ± 0,83 |
81,51 ± 1,54 |
Ранний апоптоз, % клеток |
19,06 ± 0,82 |
18,26 ± 1,53 |
Поздний апоптоз, % клеток |
0,05 ± 0,01 |
0,11 ± 0,02 * |
Некроз, % клеток |
0,06 ± 0,01 |
0,13 ± 0,03 * |
Примечание. * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 1.
На следующем этапе работы нами исследовано влияние уремической плазмы на апоптоз интактных лимфоцитов. Предпосылками для проведения эксперимента явились данные о том, что факторами преждевременной гибели Т- и В-лимфоцитов, дендритных клеток при ХПН выступают азотемия, избыток в крови продуктов пероксидации липидов, паратиреоидного гормона, железа и окисленных липопротеинов низкой плотности [15]. Одним из механизмов Т-лимфоцитопении выступает повышение концентрации в плазме крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, индоламина-2,3-диоксигеназы (IDO) и аргиназы I типа (ARG), участвующих в катаболизме соответственно триптофана и аргинина. Установлены проапоптотическое и антипролиферативное действие IDO и ARG на Т-клетки, их концентрация в крови обратно пропорциональна абсолютному количеству Т-лимфоцитов у диализных больных [12]. Кроме того, IDO рассматривают как фермент с иммуномодулирующими свойствами, возможно, участвующий в регуляции выраженности воспалительного процесса, прогрессировании атеросклероза и ИБС при ХПН, уровень IDO в плазме отрицательно коррелирует с концентрацией ИЛ-6 и СРБ.
Нами установлено, что инкубация уремической плазмы с интактными лимфоцитами приводит к увеличению количества лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране маркеры одновременно позднего апоптоза и некроза (Annexin-5-FITC+/7-AAD+), а также маркеры некроза (Annexin-5-FITC–/7-AAD+) (табл. 2). Количество клеток с признаками раннего апоптоза, а также количество интактных лимфоцитов значимо не изменилось. По данным других исследователей, инкубация изолированных от здоровых доноров лимфоцитов с уремической плазмой приводила к снижению количества жизнеспособных и функционально активных клеток, что связывают с эффектами окисленными липопротеинами низкой плотности (OxLDL). В условиях in vitro OxLDL дозо-зависимо активируют апоптоз и снижают количество Tregs в связи с повышением уровня в клетках р27Kip1, ингибитора циклин-зависимой киназы, блокирующих клеточный цикл в фазе G1. Кроме того, OxLDL активируют Fas-опосредованный апоптоз CD4 + Т-лимфоцитов в связи со снижением экспрессии рецептора к ИЛ-2.
Таким образом, у больных ХПН, находящихся на гемодиализной терапии, в периферической крови увеличивается количество лимфоцитов с ранними и поздними признаками апоптоза, признаками некроза и, как следствие, снижается количество интактных лимфоцитов. Факторами активации гибели лимфоцитов выступают вещества, находящиеся в плазме крови, т.к. добавление плазмы крови больных ХПН к лимфоцитам здоровых людей приводит к увеличению количества клеток с признаками некроза и апоптоза.
Рецензенты:
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;
Абрамовских О.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 04.02.2014.
Библиографическая ссылка
Осиков М.В., Агеев Ю.И., Черепанов Д.А., Гизингер О.А., Аклеев А.А., Федосов А.А. РОЛЬ УРЕМИЧЕСКОЙ ПЛАЗМЫ В АКТИВАЦИИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ, НАХОДЯЩИХСЯ НА ГЕМОДИАЛИЗЕ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 2. – С. 132-135;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=33561 (дата обращения: 27.09.2024).